大肠杆菌感受态细胞制备.docx

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.将适合菌株(如XLl-Blue,DH5。)置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°(250-500ml)以备第二天摇瓶用
.准备几瓶灭菌水(),保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天:
.(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板£恐?
.37°C下剧烈振荡培养2-(培养1小时后每半小时测定一次)
.-L0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时).细胞在4°C5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)
.用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升),然后加水稀释至离心管的2/3体积。
.照上面步骤重复离心,
.离心,、冰冷后的10%,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)
.用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-,于-80。C保存
转化方法:
.在冰上解冻电感受态细胞添加1TO|J1DNA,-3|J1DNA,冰上培育约5分钟
.转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡),准备好300p1LB或2xYT
.对电穿孔容器进行脉冲(200欧姆,25|JFd,)(检查时间常数,应该在3以上).立即添加300|j1的LB或2xYT至电穿孔容器中
.37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天:
.将适合菌株(如XLl-Blue,DH5a)置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°(250-500ml)以备第二天摇瓶用
.准备几瓶灭菌水(),保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天:
.-lml过夜培养物至装有500mlLB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板£恐?
.37°C下剧烈振荡培养2-(培养1小时后每半小时测定一次)
.-,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时).细胞在4°C5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)
.用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升),然后加水稀释至离心管的2/3体积。
.照上面步骤重复离心,
.离心,、冰冷后的10%,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)
.用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-|j1等份装入微量离心管,于-80。C保存
转化方法:
.在冰上解冻电感受态细胞添加l-10p1DNA,-3口1DNA,冰上培育约5分钟
.转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡),准备好300|j1LB或2xYT
.对电穿孔容器进行脉冲(200欧姆,25|JFd,)(检查时间常数,应该在3以上).立即添加300口1的LB或2xYT至电穿孔容器中
.37°
大肠杆菌感受态细胞的五种制备方法方法一:
细菌转化的方法多以Mendel和Higa(1970)的发现为基础,其基本方法是用冰预冷的CaCI2或多种2价阳离子等处理细菌,使之进入感受态得以转化。
用CaCI2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞,常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株,且迅速、重复性好。操作过程简述如下。
℃培养16〜20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52),或1ml新鲜的16〜20h过夜培养物,转到一个含有lOOmILB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2〜3h(旋转摇床200〜300r/min),每隔20〜,用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中,在冰上放置10~20min。
.于4℃用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心lOmin,以回收细胞。
.倒数培养液,将管倒置lmin以使最后残留的痕量培养液流尽。
.,放于冰上。
.于4℃用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心lOmin,以回收细胞。
7,倒出培养液,将管倒置lmin以使最后残留的痕量培养液流尽。
.,此时,可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻,-70℃贮存备用。
.用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取2003转移到无菌的微量离心管中,每管加DNA或连接反响混合物(体积V103,DNA<50ng),轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min。
Q将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上,放置90s〜2min,不要摇动试管。
1快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1〜2min。
每离心管加800HISOC培养基,用水浴将培养基加温到37℃,然后将管转移到37c摇床上,温育45min使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。(每个90mm平板可达200^1)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/lMgS04和相应抗生素的SOB培养基上。
.将平板置于室温至液体被吸收。
.倒置平皿,于37℃培养,12~16h后可出现菌落。
方法二:
CASsuperOne-StepCompetentCellPrepsKit采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌,使其成为感受态细胞,便于质粒DNA的转化,可满足一般实验的要求。与CaCI2法相比具有多种优点:使用方便,只需一步即可完成感受态细胞的制备;转化效率略高于CaCI2法,一般可达106-lOScfu/tig,满足一般实验需要;感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油,并且经长期保存活力无明显下降。
准备工作:
.从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落。挑形态饱满的单菌落2个,分别接种5mlLB培养基中,37℃,250rpm,过夜培养。
.次日从5mlLB培养物吸取200Hl转入50mlLB培养基中(250ml锥形瓶),37℃,250rpm培养2小时,此时OD600约。
感受态细胞的制备:
.,5000rpm离心5分钟,弃去上清。
.加入1003预冷的SolutionA,悬浮菌体,冰浴30分钟。
.此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。
细胞转化:
.在感受态细胞中加入100pg-10ngDNA,混匀,冰浴30分钟,然后42℃1分钟热击,再次冰浴2分钟。,20plSolutionB,37℃,振荡培养1小时。
.取适当菌液(100-200|11)涂布相应抗性的平板。
.过夜培养约16个小时,数菌落数,计算转化率。
补充说明:
.所用器具一定要清洁;.操作步骤2中培养基的装量也是很重要的,建议装量不要高于此值:500ml锥形瓶装100ml培养基,250ml锥形瓶装50ml培养基;
.在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCI2,效果会更好一些;.为保证细胞处于对数生长期,;
.制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作;.细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击,冰浴后直接加入新鲜LB,简化操作步骤,但转化效率低于热击方法,适用于对转化率要求不高的实验。
方法三:
1、取1%,37℃振荡培养过夜2、,37℃振荡培养3h至OD600=
3、,冰浴lOmino4、在4℃F以4000rpm离心5min,去上清液
5、,置冰上30min6、然后再在4℃下以4000rpm离心lOmin,去上清液
7、,冰浴放置4・12hr备用。
方法四:
(1)将1ml过夜培养的细菌(如DH52、TGI、TM101)接种于100ml2xYT培养于500ml烧瓶。于37℃刷烈振荡,〜(5xl07cells/ml),需2〜4ho
(2)将培养物放于冰上致冷lOmin,于4℃离心细菌培养物,lOOOOrpm离心ldmin。
(3)弃除上清,将细菌悬浮于原始培养体积的一半(约50ml)的50mMCaCI2和10mmTris<HCI()无菌冷冻液体中。
(4)将细菌悬浮放在冰上约5min,然后将悬浮物于4℃10000/rpm离心10mino
(5)弃上清,悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCI和10mMTris*HCI()无菌冷冻中。此时的细胞是感受态细胞,即可用于转化。,℃冰箱中。
方法五:TSB法(也是本人热衷的方法).药品制备
IMMg2+(IMMgS04和IMMgCI2等体积混合),。
TSB液(30mL/80mL菌液)(现配现用):


以上1210C"5min灭菌后,加入IMMg2+600uL,:
(1)活化菌株
(2)挑单菌落培养于5mL的液笨培养基中
(3)取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养
370c培养3—4小时,OD600在
(5)离心,去上清
(6)加入20mLTSB,重悬
(7)离心,去上清
(8)加入lOmLTSB,再加入15—20%的甘油,分装保存注,整个操作过程均应在冰上进行。所用药品均需灭菌。转化程序1)取出2004感受态细胞慢慢使其溶化,并立即放于冰上,加入DNA或连接反响混合物,DNA量通常V50mg。用手指弹打试管10次,使之混匀,然后放在冰上40〜45min。
(2)将管放于42℃水浴中2mino
(3),倒置混匀,并于37c培养8~12h,干浴或水浴,不需振摇。此期间使细菌生长并开始表达抗菌素。
(4)每200Hl转化混合物分别于6个2xYT琼脂培养板上补充相应抗生素,并含有X-gal
(20mg/ml)>IPTG(200mg/ml)o
(5)铺板使细菌混合物干后,倒转平板放于30〜37c培养箱中18〜22h。克隆在此期间应该出现,否那么转化不成功。
常用的大肠杆菌感受态细胞的制备方法除以上几种外,还有很多。各种方法都各有其优缺点,我们在选择方法的时候应根据自己实验具体情况而定。以期获得最高的转化效率大肠杆菌感受态细胞的制备(实验室修改版)
从-70冰箱取出菌种。按1:1000比例接种复壮。
划线培养到LB平板上,30度,16-20h.
挑单菌落,取5ml摇过夜。
接1ml加入到15ml培养基的比例,用大瓶摇(保证供氧)。18度,摇6h以上(按实际生长情况延长。
。
4000rpm,10分钟。
%甘油重悬。
200微升每份包装,-70保存.
视情况而定,第一步可省略,这个方法是我们实验室综合几种方法而改进的,用的情况不错,效率也挺高,可以保存至少两个月。