miR-125a-3p靶向作用P2RX7抑制糖尿病肾病小鼠肾纤维化发展.pdf

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CN43-1509/R2022505661
蒋伟郑东辉李海伦等靶向作用抑制糖尿病肾病小鼠肾纤维化发展中南医学科学杂志
,,,.miR-125a-3pP2RX7[J].,2022,50(5):661-665.
:·基础医学·
.43-1509/
靶向作用抑制糖尿病肾病
miR-125a-3pP2RX7
小鼠肾纤维化发展
蒋伟,郑东辉,李海伦,徐永
(徐州医科大学附属淮安医院肾脏内科,江苏省淮安市)
223002
[关键词];糖尿病肾病;肾纤维化;
miR-125a-3pP2RX7
[摘要]目的探究靶向作用对糖尿病肾病()小鼠肾纤维化发展的影响。方法
miR-125a-3pP2RX7DN60
只小鼠均分为对照组、模型组、组和组,构建小鼠模型,腹腔注射
miR-125a-3pNCmiR-125a-3pmimicDNmiR-125a-
或。检测肾组织表达,检测、、蛋白表达,
3pNCmimicqRT-PCRmiR-125a-3pWesternblottingP2RX7Col-Iα-SMA
检测血肌酐()和血尿素氮(),染色和染色检测肾脏病理改变和胶原蛋白体积分数
ELISACrBUNHEMasson
(),双荧光素酶报告检测与的靶向关系。结果与对照组比较,模型组和
CVFmiR-125a-3pP2RX7miR-125a-3p
组、、和、和蛋白升高,表达降低(P);与模型组和
NCP2RX7CrBUNCVFCol-Iα-SMAmiR-125a-3p<-125a-
组比较,组上述趋势得到逆转(P)。可与靶向结合(P)。
3pNCmiR-125a-3pmimic<-125a-3pP2RX7<
结论高表达靶向抑制蛋白,缓解小鼠的肾纤维化,保护肾功能。
miR-125a-3pP2RX7DN
[中图分类号][文献标识码]

miR-a-ptargetingPRXinhibitsthedevelopmentofrenalfibrosisinmicewith
125327
diabeticnephropathy
JIANGWei,ZHENGDonghui,LIHailun,XUYong
DepartmentofNephrologyAffliatedHuai'anHospitalofXuzhouMedicalUniversityHuai'anJiangsuChina
(,,223002,,)
KEYWORDS
[]miR-125A-3p;diabeticnephropathy;renalfibrosis;P2RX7
ABSTRACTAim
[]ToexploretheeffectofmiR-125a-3ptargetingP2RX7onthedevelopmentofrenalfibrosisin
Methods
diabeticnephropathy(DN),modelgroup,miR-
125a-3pNCgroupandmiR-125a-,andtheintraperitonealinjectionof
miR-125a--125a-3pwasdetectedbyreal-timequanti-
tativepolymerasechainreaction(qRT-PCR).TheproteinexpressionofP2RX7,Col-I,andα-SMAwasdetectedby
(Cr)andbloodureanitrogen(BUN)weredetectedbyenzyme-linkedimmu-
nosorbentassay(ELISA).Thepathologicalchangesofthekidneyandtissuecollagenvolumefraction(CVF)wereob-
servedbyHEstainingandMassonstaining,andthetargetingrelationshipbetweenmiR-125a-3pandP2RX7wasdetected
Results
bydual-,theP2RX7,Cr,BUNandCVF,Col-Iand
α-SMAproteinsinthemodelgroupandthemiR-125a-3pNCgroupwereincreased,andtheexpressionofmiR-125a-3pwas
P
decreased(<).TheabovetrendwasreversedinmiR-125a-3pmimicgroupcomparedwithmodelgroupandmiR-
PPConclusion
125a-3pNCgroup(all<).miR-125a-3pcouldtargetandbindtoP2RX7(<).The
highexpressionofmiR-125a-3pcanrelieveDN-inducedrenalfibrosisandprotectrenalfunctionviatargetingP2RX7.
糖尿病肾病是糖尿激活体内活性氧导致肾组织脂质过氧化炎症反
(diabeticnephropathy,DN),、
病最主要的并发症之一病程中晚期糖基化终应和促纤维化因子产生进而促进肾纤维化进程从
,DN,
末产物蓄积而影响肾脏的正常功能[1]目前关于肾纤维化的分
(advancedglycationend-products,AGE),
[收稿日期][修回日期]
2021-11-022022-06-20
[基金项目]江苏卫生健康委科研项目
(H2019062)
[作者简介]蒋伟主治医师研究方向为肾脏纤维化为通信作者郑东辉博士主任医师研
,,,E-******@。,,,
究方向为肾脏纤维化为
,E-******@。
662ISSN2095-1116MedicalScienceJournalofCentralSouthChina,Vol50,No5,2022
子机制仍不清楚是近年新发现的纤进行反应:,,
。miR-125a-3pqRT-PCR95℃2min58℃20s72℃
维化相关微小体外研究(个循环),以为内参,使用-ΔΔCt法计算
RNA(microRNA,miRNA),20s40U62
显示可调控成纤维细胞增殖和细胞外相对表达水平。
miR-125a-3pmiR-125a-3p
基质累积[2]也有研究显示发生后检测、、蛋白
。DNmiR-125a--Iα-SMA
降低进而参与视网膜病变[3]提示肾组织裂解后离心(,,)
3p,DN,miR-4℃12000r/min5min
可能参与肾纤维化但其调节机制仍不收集总蛋白。分离蛋白,转
125a-3pDN,10%SDS-PAGE40μg
清楚是一种门控离子通道参与调节移到***纤维素膜上。加入脱脂牛奶(室温,
。P2RX7ATP,5%
免疫炎症和肿瘤的进展研究表明药理学)封闭后加入抗、抗、抗(
、,P2RX72h-P2RX7-Col-I-α-SMA1∶
抑制可缓解肝组织纤维化[4]对肾纤维,,),洗涤后加入二抗(,室温,
,P2RX7DN8004℃8h1∶2000
化的机制仍不清楚因此本文探讨)。条带用可视化处理,为内参,计
。,miR-125a-3p1hECLGAPDH
靶向作用对小鼠肾纤维化发展的影响算、、蛋白的相对表达量。
P2RX7DN。P2RX7Col-Iα-SMA
检测血肌酐和血尿素氮

取小鼠尾静脉血,半径离心
材料和方法8cm3000r/min
1,收集上清,分别加入抗体和显色剂,终止显
15min
主要实验材料色反应后内检测光密度(),根据标准

小鼠(级,雄性,周龄,)。曲线计算肾功能指标血肌酐(,)和血尿
C57BL/6SPF620~25gcreatinineCr
试剂盒、染色试剂盒、染色试剂盒(碧素氮(,)水平。
ELISAHEMassonbloodureanitrogenBUN
云天公司,中国)。质粒、类似物染色观察肾脏病理改变
P2RX7miR-125a-
()及阴性对照(,)(吉玛公司,肾组织用甲醛溶液固定,流水冲洗。
mimicnegativecontrolNC10%48h
中国)。和试剂盒(梯度乙醇脱水,然后将组织浸入蜡中,切厚
TRIzolmirNeasyminiQIAGEN5μm
公司,德国)。试剂盒度。载玻片恒温烘箱中。脱蜡水化后
GmbHSYBRPremixExTaqTM65℃30min
(公司,日本)。仪(,公司,染色。细胞核用苏木精染色,细胞质用伊红染
TaKaRaPCRABI7900ABI5min
美国)。一抗()、胶原蛋白(色。染色切片用乙醇脱水并在显微镜下观
P2RX7ab48871Icollagen1~2min
,)一抗()和平滑肌肌动蛋白(
ICol-Iab255809α-α-察拍照。
,)()一抗(
smoothmuscleactinα-SMAab40854Abcam染色检测肾纤维化
公司,美国)。
ECLNanodrop2000将切片标本加入三色染料染色,根
(公司,美国)。肾胚细胞(公司,
ThermoFisherATCC据试剂盒说明书方法操作,显微镜下观察并拍照,
美国)。突变试剂盒和荧光素酶(公
RenillaBeyotime利用图像分析系统计算胶原蛋白体积分数
司,中国)。荧光素酶试剂盒(公司,美国)。
Promega(,)。
小鼠建模和分组干预collagenvolumefractionCVF

只小鼠随机均分为对照组、-125a-3pP2RX7
60C57BL/6关系
组、组和组。除通过网站得到与
miR-125a-3pNCmiR-[12]5a-3pmimic
对照组外,其他小鼠参考文献5高糖高脂配合StarbasemiR-125a-3pP2RX7
STZ的碱基结合位点。根据其原始序列,将的
诱导构建小鼠模型,小鼠尾静脉空腹血糖P2RX73'
DN>端非翻译区域(,)负载
、尿量对照组提示建模成功。3'-untranslatedregion3'-UTR
>50%于荧光素酶载体上作为野生型();
建模后组和组pGL4WT-P2RX7
miR-125a-3pNCmiR-125a-3pmimic利用突变试剂盒生成突变型()。根据
小鼠分别腹腔注射或MUT-P2RX7
DNmiR-125a-3pNCmiR-上述转染方法,分别将及
[]1μgWT-/MUT-P2RX7
6
(,每周次);对照组和模质粒转染4
125a-3pmimic300μg250nmol/LmiR-125a-3pmimic/NC1×10
型组注射等量生理盐水为对照。周后,收集小鼠个人胚胎肾干细胞()中。后根据
8HEK29336h
尾静脉血,***小鼠收集肾组织。计算细胞荧光素酶活性。
Renilla
检测表达统计学处理
-PCRmiR-125a-
使用试剂从肾组织中提取总,使用软件进行数据统计分析。数据以
TRIzolRNANan-SPSS19
进行定量。使用试剂盒将xs表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比
odrop2000mirNeasyMini±
进行反转录,使用较使用检验。P为差异有显著性。
miRNASYBRPremixExTaqTMSNK-q<
中南医学科学杂志年第卷第期
CN43-1509/R2022505663
结果对肾功能指标的影响
-125a-3p
2与对照组比较其他组和水平均升
各组和蛋白表达水平的比较,3CrBUN
-125a-3pP2RX7高P与模型组和组比较
与对照组比较其他组蛋白表达升(<);miR-125a-3pNC,
,3P2RX7组上述趋势得到逆转P
高表达降低P与模型组和miR-125a-3pmimic(<;
,miR-125a-3p(<);表
组比较组上述2)。
miR-125a-3pNC,miR-125a-3pmimic
趋势得到逆转P图和表表2miR-125a-3p对DN小鼠肾功能指标的影响n
(<;11)。(=15)
分组
Cr/(μmol/L)BUN/(mmol/L)
对照组
±±
模型组aa
±±
组aa
图1各组P2RX7蛋白表达水平的比较miR-125a-±±
组abcabc
为对照组为模型组为组为组miR-125a-±±
1;2;3miR-125a-3pNC;4miR-125a-3pmimic。注为P与对照组比较为P与模型组比较
:a<,;b<,;c
为P与组比较
表1各组小鼠肾组织P2RX7蛋白和miR-125a-3p<,miR-125a-3pNC。
表达的比较n
(=15)对肾组织病理学改变的影响
-125a-3p
miR-125a-3pP2RX7对照组细胞排列规则肾小球和肾小管结构完
对照组,
±±
模型组aa;miR-125a-3pNC
±±
组aa,;miR-
miR-125a-±±
组abcabc125a-3pmimic
miR-125a-±±
注为P与对照组比较为P与模型组比较,miR-125a-3pNC
:a<,;b<,;c
为P与组比较轻图
<,miR-125a-3pNC。(2)。
图2miR-125a-3p对DN小鼠肾组织病理学改变的影响染色
(HE,40×)
对的影响出现少量蓝色胶原纤维较模型组和
-125a-3pCVF,miR-125a-3p
对照组着色均匀无明显蓝色胶原纤维提示组少提示肾组织部分异常与对照组比较模
,,NC,。,
肾组织正常灰蓝色或灰色为纤维化组织和胶原蛋型组和组均升高P
,miR-125a-3pNCCVF(<);
白模型组和组出现明显蓝色胶与模型组和组比较
。miR-125a-3pNCmiR-125a-3pNC,miR-125a-3p
原纤维提示肾组织异常而组组上述趋势得到逆转P图
,;miR-125a-3pmimicmimic(<;3)。
图3miR-125a-3p对DN小鼠肾组织纤维化的影响染色
(Masson,40×)
为对照组为模型组为组为组
1;2;3miR-125a-3pNC;4miR-125a-3pmimic。
为P与对照组比较为P与模型组比较为P与组比较
a<,;b<,;c<,miR-125a-3pNC。
664ISSN2095-1116MedicalScienceJournalofCentralSouthChina,Vol50,No5,2022
对和蛋白水平的影响
-125a-3pCol-Iα-SMA讨论
与对照组比较模型组和组3
,miR-125a-3pNC
和蛋白水平升高P与模型组糖尿病肾病典型的
Col-Iα-SMA(<);(diabeticnephropathy,DN)
和组比较组上病理改变为肾小球及肾小管基底膜增厚肾小管间
miR-125a-3pNC,miR-125a-3pmimic、
述趋势得到逆转P图质纤维化等若其纤维化得不到有效控制则会发
(<;4)。。,
展为肾小球硬化和肾间质纤维化甚至终末期肾功
,
能衰竭[7]
。
可通过碱基配对识别并结合进
miRNAmRNA,
而诱导的降解或者抑制翻译[8]
mRNA。miR-125a-
是近年来新发现的与糖尿病和纤维化相关的
3p
细胞实验结果表明会引起
miRNA,DNmiR-125a-3p
的水平升高引起相关动脉损伤[9]
,DN。miR-125a-
通过下调系统性红斑狼疮介导的肾炎小鼠中的
3p
表达来抑制肾纤维化[10]相关研究发现
TGF-β1。
可以通过调控通路缓解成纤维
miR-125a-3pSTAT3
细胞活化此外还可以调节自噬参与四***化碳诱
,,
导的小鼠模型肝纤维化[11-12]为初步分析
。miR-
是否参与了引起的肾纤维化本研究成
125a-3pDN,
图4Westernblotting检测miR-125a-3p对DN小鼠功构建模型并成功促进了肾纤维化发现肾组
DN,,
Col-I和α-SMA蛋白水平的影响织中水平降低为进一步证实
miR-125a-3p。miR-
为对照组为模型组为组
1;2;3miR-125a-3pNC;在引起的肾纤维化中的作用本研究利
为组125a-3pDN,
4miR-125a-3pmimic。用提高小鼠水
为P与对照组比较为P与模型组比较miR-125a-3pmimicDNmiR-125a-3p
a<,;b<,;平本实验结果表明提高水平可显
为P与组比较。,miR-125a-3p
c<,miR-125a-3pNC。著缓解小鼠肾组织损伤抑制肾纤维化保护肾
DN,,
对的靶向作用功能本研究在动物水平上证实参与
-125a-3pP2RX7。miR-125a-3p
与存在靶向结合位点转了诱导的肾纤维化而提高水平可
miR-125a-3pP2RX7,DN,miR-125a-3p
染和后细胞中相显著缓解纤维化
MUT-P2RX7miR-125a-3pmimic,。
对荧光素酶活性降低P图证明蛋白是的受体通过形成可渗透
(<;5),miR-P2RX7P2X7,
与靶向结合大分子的膜孔负责巨噬细胞的依赖性裂
125a-3pP2RX7。,ATP
解[13]研究显示的接触抗击可减轻肾脏
。,P2RX7
炎症的早期阶段间质纤维化并与输尿管梗阻中
、,
的肾细胞增殖有关[14]也有研究显示抑制
。,P2RX7
通过抑制通路而下调和
NLRP3/IL-1βCol-Iα-SMA
的表达改善心脏纤维化[15]是细胞外基质
,。Col-I
的主要成分也是引起纤维化和肾功能障碍的重要
,
蛋白[16]是促进肾上皮细胞转化为肌成纤
。α-SMA
维细胞的重要蛋白进而促进纤维化进程[17]本研
,。
究结果显示在纤维化肾组织中水平显
,DN,P2RX7
著升高和蛋白升高而提高
,Col-Iα-SMA,miR-
表达则会恢复蛋白的表达水平并
125a-3pP2RX7,
抑制和的表达此外双荧光素酶报
Col-Iα-SMA。,
图5miR-125a-3p对P2RX7的靶向调节作用告实验也验证了与靶向结合
miR-125a-3pP2RX7。
为与结合位点为荧光素酶活性柱状图
AmiR-125a-3pP2RX7;B。本研究结果表明会引起肾组织中
为P与组比较,DNmiR-125a-3p
a<,miR-125a-3pNC;的降低从而导致的过表达进而导致
为P与比较,P2RX7,Col-I
b<,MUT-P2RX7。和蛋白的升高引起肾纤维化而提高
α-SMA,;miR-
中南医学科学杂志年第卷第期
CN43-1509/R2022505665
的水平可通过抑制蛋白等的水平抑
125a-3pP2RX7throughcircularRNA-miRNA-mRNAaxis[J].Genomics,2020,
制纤维化保护肾功能112(2):1680-1685.
,。
然而本研究也有一定的局限性首先[9]YED,LOUGH,LIAC,-125a-mediatedregula-
,,,miR-
与的相关性以及在引起的肾纤tionofthemevalonatesignalingpathwaycontributestohighglucose-
125a-3pP2RX7DNinducedproliferationandmigrationofvascularsmoothmusclecells
维化的作用仍需要临床研究证实
,DN、miR-125a-3p[J].MolMedRep,2020,22(1):165-174.
以及之间调控的分子机制仍需要进一步
P2RX7[10]ZHANGY,CHENX,-125a-3pdecreaseslevelsof
分析interlukin-17andsuppressesrenalfibrosisviadown-regulating
。
综上所述升高会通过靶向抑制TGF-β1insystemiclupuserythematosusmediatedlupusnephritic
,miR-125a-3p
蛋白的表达缓解引起的肾纤维化保护mice[J].AmJTranslRes,2019,11(3):1843-1853.
P2RX7DN,[11]XUQ,LIUY,PANH,-125a-
肾功能这提示可能是治疗
。miR-125a-3p/P2RX73ppromotesfibroblastactivationviaFyn/STAT3pathwayduring
肾纤维化的新靶点
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