文档介绍：双脱氧链终止法又称为Sanger法
原理是:核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸( d NTP,其中的一种用放射性P32标记)存在条件下复制时,在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸( dd NTP ),因为双脱氧核苷没有3’-O H,所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长,若链端掺入单脱氧核苷,链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自
的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后,分4个泳道进行凝胶电泳,分离长短不一的核酸片段,长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后,根据片段3’端的双脱氧核苷,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。Sanger法因操作简便,得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种 DNA 测序技术,其中最重要的是荧光自动测序技术。
荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理,用荧光标记代替同位素标记,并用成像系统自动检测,从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。20世纪80 enson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。
1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法,并采用激光聚焦荧光扫描检测装置,25只毛细管并列电泳, bp,DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究,使用四色荧光标记法,,在9min内可读取150个碱基,准确率约 97 % 。目前, 应用最广泛的应用生物系统公司( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时
不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, D 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。
杂交测序技术杂交法测序是20世纪80年代末出现的一种测序方法, 该方法不同于化学降解法和Sanger 法, 而是利用 DNA杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列
序检测速度快, 采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本,具
有部分第二代测序技术的特点。但该方法误差较大, 且不能重复测定
焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是近年来发展起来的一种新的DNA序列分析技术,它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应,促使荧光素发光并进行检测。既可进行DNA序列分析,又可进行基于序列分析的单核苷酸多态性(SNP)检测及等位基因频率测定等。
1 焦磷酸测序技术的原理及步骤
焦磷酸测序是由DNA聚合酶(DNA polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(1ueiferase)和双磷酸酶(apyrase)4种酶催化同一反应体系的酶级联化学发光反应,反应底