文档介绍：哺乳动物细胞表达系统
研究现状
①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ,集落刺激因子等。有些产品已投入临床应用或试用。
1 表达载体
表达栽体的类型
哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间,而利用病毒表达系统则可快速感染细胞,在几天内使外源基因整合到病毒载体中,尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。根据进入宿主细胞的方式,可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体是以病毒颗粒的方式,通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外,杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视,这是因为它与其它病毒载体相比有特有优势,如可通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒;可感染多种哺乳动物细胞,但在细胞内无复制能力,生物安全度高;可插入高达38 kb的外源基因等。
质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力,可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能力,需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在,如SV40病毒载体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。利用 Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒载体感染哺乳动物细胞表达的蛋白在结构与功能上与天然哺乳动物来源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒载体感染哺乳动物细胞获得的外源蛋白占细胞总蛋白的;而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体,其外源基因的表达受插入位点的影响,同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下,附加体型载体不存在这方面的问题,但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。
附加体型载体在胞内的复制需要两种病毒成分:病毒DNA的复制起始点(ori)及复制相关蛋白。根据病毒成分的来源不同,附加体型表达载体主要分为4大类,表2对这几类附加体载体进行了简要的概括。
载体的选择取决于外源基因的导人方式和其调控元件是否有利于转录和翻译。真核
生物基因高表达载体必须具有如下调控元件:
①原核DNA序列,包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子,便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基躅,以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。目前采州的哺乳动物细胞表达戟体大都带有来自pBR322的衍生质粒如pX[3、pBRd和pM[的原核序列;
②启动子和增强子;
③剪接信号;
④终止信号和poIyA加尾信号。
。常用的标记基因有胸腺激酶(tk)基因、二氢叶酸还原酶(dh]r)基因、新霉素(neo)抗性基因、***霉素乙酰基转移酶(cat)基因等dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当培养基中逐新增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度时,随着细胞对MTX抗体的增加。dhfr基因与外源基因均明显扩增。据文献报道,在不断提高的选择压力下,dhfr及侧翼序列能扩增至上千个拷贝,大大增加目的基因的表达水平。
表达载体的结构元件
哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括:一个高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的mRNA翻译信号。可视实验需要加入标志基因、复制起始点序列、内部核糖体进入位点等。基于启动子/增强子是表达载体中最重要的元件,我们这里仅对它做简要介绍。外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关,主要是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。
启动子需包含两个识别序列:mRNA转录起始点和TATA盒。TATA盒位于转录起始值点上游25--30bp处,是引导RNA聚合酶在正确起始位点转录所必需的序列,即保证转录的精确起始。其他上游启动子元件常位于TATA盒上游100~200bp之间。其功能是调节转录的起始频率和提高转录效率。启动于和增强子受细胞类型的限制,在不同的细胞系中有很大不同,因此需根据宿主细胞的娄型选择不同的启动子和增强子以便于目的基因的高效表达。目前常用的强启动子包括人巨细胞病毒早期启动子
(CMV-IE)、人延伸因子1-亚基启动子和Rous肉瘤长末端重复序列;Invitrogen公司开发的pcDNA、pEF和pRL三种系列载体即分别是以这三种启动子驱动目的基因的表达。近年来又发现了一些新的强启动