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从含蛋白质溶液中纯化蛋白质的方法 1.docx

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专利名称:从含蛋白质溶液中纯化蛋白质的方法
技术领域:
本发明是一种简单、廉价并十分有效的结晶存在于含蛋白质溶液(如发酵肉汤)中的蛋白质(特别是酶)的方法。
背景技术:
工业用酶通常以液体或者无定形固体形式提供。它们之所以以无定形固体而不是以结晶固体供给,主要是因为一般都认为已知的结晶酶的方法太昂贵而不能应用于工业领域。
有关酶结晶有大量文献。由于结晶酶的技术具有很强的经验性,因而很难对特定结晶过程的结果一概而论。
现在大多数已知的蛋白质结晶方法的特有的要求是纯净的、浓缩的原始溶液;长的结晶时间;大量的化学药品,例如盐(参见,例如,生物技术和生物工程48(1995)-323)。
已描述一种工业酶的结晶过程,其中使用了一种水溶性聚合物(如聚乙二醇)(参见WO95/01989)。
发明概述本发明的目的是提供一种有效、廉价的方法,通过该方法可从含蛋白质溶液中获得晶态蛋白质,特别是晶态酶,而且该方法不需要加入大量的化学药品(如盐)。本发明的方法的一个重要且十分有价值的特征是它能够从不纯的含蛋白质溶液(即除了含有所研究的蛋白质之外,还含有不同的其它物质的溶液)中分离出高纯度的晶态蛋白质,特别是晶态酶。不纯的溶液尤指含有其它蛋白质的溶液,如来源于发酵内汤的溶液。本发明使短结晶时间内获得高产率成为可能,而且该方法简单、廉价、对环境无害、适合工业需求。
如前所说,本发明提供了一种以晶态形式从含蛋白质溶液(例如包含一种以上的蛋白质溶液,如来源于发酵肉汤的溶液)纯化、分离蛋白质的方法,该方法包括(a)利用结晶有效量的与水混溶的有机溶剂处理含蛋白质溶液;然后(b)以晶态形式分离所研究的蛋白质。
应该了解本发明中特别相关的含蛋白质溶液是含水溶液(即,一般来说,其中水构成基本上所有或至少大部分溶剂,兴趣蛋白质溶解于该溶剂中的溶液)。
发明详述本发明特别提供了一种结晶存在于发酵肉汤中的蛋白质(或多肽)的方法。就此而言,术语"发酵"不仅指由微生物(如细菌或真菌)引起的分解或转化过程,而且指由于动植物来源的细胞的作用引起的相应过程。
发酵肉汤除了包含兴趣蛋白质或多肽外,通常还包含如底物化合物如碳水化合物、盐、细胞和其它代谢物(如核酸,特定的兴趣蛋白质或多肽之外的蛋白质或多肽)之类的许多其它物质。
当将本发明的方法运用于发酵肉汤时,最好首先对内汤进行一次或多次固/液分离技术处理,例如絮凝、离心、过滤或微量过滤,或者是它们之间的任意组合。
本发明的方法显得对相对不纯的溶液作用效果非常好,在使用本发明的方法之前,通常不再需要通过层析方法(例如,从溶液中分离出无关蛋白质)纯化发酵肉汤(或含蛋白质溶液,通过使用固/液分离技术处理发酵肉汤获得)。
本发明的另一方面,在用有机溶剂处理之前,浓缩含蛋白质溶液。浓缩过程适合通过一个或多个已知的步骤来完成,例如超滤(逆渗透)或蒸发。
本发明的又一方面,含蛋白质溶液要经过去除低分子量物质(例如盐)的步骤。这样的处理包括渗滤和透析。
虽然含蛋白质溶液的浓缩对实施本发明的方法来说不是十分重要的,但它经常是出于产量和易于操作观点的考虑。一般地说,依据本发明,-25%(重量)范围内(%w/w;基于含蛋白质溶液的重量),-15%w/w的范围内,特别是在5-15%w/w范围内。
如上文所说明的,本发明中优选的蛋白质是酶,例如水解酶(EC3)[包括蛋白酶(肽酶,);羧基酯水解酶(),如脂肪酶(例如三酰甘油脂肪酶,);糖苷酶(),如淀粉酶(例如α-淀粉酶,,β-淀粉酶,,),纤维素酶(例如内-1,4-β-葡聚糖酶,)和木聚糖酶(例如内-1,3-β-木糖苷酶,)]
;氧化还原酶(EC1)[包括酚氧化酶如漆酶();过氧化物酶(),];以及异构酶(EC5)[包括木糖异构酶()]。
酶本说明书和权利要求书中使用的酶分类号(EC号)依据国际生物化学和分子生物学联合命名委员会的推荐的命名法(1992)(学院出版公司,1992)。
蛋白酶按照本发明的方法可使其结晶的蛋白酶(肽酶)包括利用细胞的发酵过程获得的蛋白酶,利用的细胞如微生物细胞,尤其是细菌或者真菌。也包括利用化学方法或遗传方法修饰的这些蛋白酶的突变体。
蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶,优选的是碱性微生物蛋白酶或类胰岛素蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶,尤其是那些从芽孢杆菌得来的枯草杆菌蛋白酶,例如枯草菌素Novo,枯草菌素Carlsberg,枯草菌素309,枯草菌素147和枯草菌素168(见WO89/06279中所述)。类胰岛素蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例猪和牛的来源)和WO89/06270中所述的镰孢属蛋白酶。
合适的市售蛋白酶包括以Alcalase、Savinase、Durazym、及Esperase商品名出售的蛋白酶(NovoNordiskA/S(丹麦));以Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase商品名出售的蛋白酶(Gist-Brocades);以Purafect与PurafectOXP商品名出售的蛋白酶
(GenencorInternational);以及以Opticlean与Optimase商品名出售的蛋白酶(SolvayEnzymes)。
脂肪酶按照本发明的方法可使其结晶的脂肪酶包括利用细胞的发酵过程获得的脂肪酶,利用的细胞如微生物细胞,尤其是细菌或者真菌。也包括用化学方法或遗传方法修饰的这些脂肪酶的突变体。
合适的脂肪酶的例子,包括Humicolalanuginosa脂肪酶,例如,如EP258068和EP305216中所描述的,Rhizomucormiehei脂肪酶,例如,如EP238023中所描述的,假丝酵母属(Candida)脂肪酶,如Candidaantarctica脂肪酶,例如,如EP21476l所描述的Candidaantarctica脂肪酶A或者B,诸如产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)和假产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcalisenes)脂肪酶之类的假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶,例如,如EP218272中所描述的,葱头假单胞菌(Pseudomonascepacia)脂肪酶,例如,如EP331376中所描述的,Pseudomonasstutzeri脂肪酶,例如,如BP1,372,034中所公开的,Pseudomonasfluorescens脂肪酶,芽孢杆菌属(Bacillus)脂肪酶,例如,枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)脂肪酶(Dartois等,(1993),生物化学生物物理学报1131,253-260),嗜热脂肪芽孢杆菌
(Bacillusstearothermophilus)脂肪酶(J1P64/744992)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)脂肪酶(WO91/16422)。
许多克隆的脂肪酶可以是本发明的兴趣酶。克隆的脂肪酶包括由Yamaguchi等描述的Penicilliumcamembertii脂肪酶,(Yamaguchi等,(1991),基因103,61-67),Geotricumcandidum脂肪酶(Schimada,,(1989),生物化学杂志106,383-388),以及各种诸如Rhizopusdelemar脂肪酶(,(1991),基因109,117-113),雪白根霉(Rhizopusniveus)脂肪酶(Kugimiya等,(1992),生物科学,生物技术,生物化学56,716-719)和Rhizopusoryzae脂肪酶之类的根霉属(Rhizopus)脂肪酶。
也可以将诸如角质酶之类的其它类型的脂解酶进行结晶,例如,如WO88/09367所描述的由门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)生成的角质酶,或者由Fusariumsolanipisi生成的角质酶(例如WO90/09446所描述的)。
尤其令人感兴趣的脂肪酶是诸如M1LipaseMT,LumafastMT和LipomaxMT(Gist-Brocades),LipolaseMT和LipolaseUltraMT(NovoNordiskA/S)的脂肪酶,以及脂肪酶P"Amano"(Amano药物有限公司)。
淀粉酶按照本发明的方法可使其结晶的淀粉酶(如α-或β-淀粉酶)包括利用细胞的发酵过程获得的淀粉酶,利用的细胞如微生物细胞,尤其是细菌或者真菌。也包括用化学方法或遗传方法修饰的这些淀粉酶的突变体。
有关的淀粉酶包括,例如,从芽孢杆菌属(Bacillus)获得的α-淀粉酶,,296,839中更详细描述的一种地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的特定菌株。市售的淀粉酶是DuramylTM,TermamylTM,FungamylTM和BANTM(由NovoNordiskA/S提供的)以及RapidaseTM和MaxamylpTM(由Gist-Brocades提供的)。
本发明相关的兴趣酶是例如从芽孢杆菌属,热厌氧菌属(Thermoanaerobactor或者Thermoanaerobacterium)获得的CGT酶(环糊精葡聚糖转移酶,)。
纤维素酶在本文中,术语"纤维素酶"指的是催化纤维素向葡萄糖降解的酶-纤维二糖,纤维三糖和其它纤维低聚糖。
本发明中特别合适的纤维素酶类型是内-1,4-葡糖酶(),优选的是重组内-1,4-葡糖酶。
按照本发明适合结晶的纤维素酶包括微生物纤维素酶,特别是细菌或真菌纤维素酶。细菌纤维素酶的有关例子是这样一些纤维素酶,它们是来源于下组细菌或者可由下组细菌产生的纤维素酶,这组细菌选自假单胞菌属(Pseudomonas),芽孢杆菌属(Bacillus),纤维单胞菌属(Cellulomonas),梭菌属(Clostridium),Microspora,栖热袍菌属(Thermotoga),Caldocellum以及放线菌属(Actinomycets)
如链霉菌属(Streptomyces),高温单孢菌属(Termomonospora)和热酸菌属(Acidothemus),特别是解纤维假单胞菌(Pseudomonascellulolyticus),灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus),粪肥纤维单胞菌(Cellulomonasfimi),Microsporabispora,褐色高温单孢菌(Termomonosporafusca),Termomonosporacellulolyticum和解纤维热酸菌(Acidothemuscellulolyticus)。
相关的纤维素酶包括这样的酸性纤维素酶,它们来源于下组真菌或者可由下组真菌产生,这些真菌选自由木霉属(Trichoderma),漆斑菌属(Myrothecium),曲霉属(Aspergillus),Phanaerochaete,脉孢菌属(Neurospora),Neocallimastix和葡萄孢属(Botrytis)组成的属,特别是选自绿色木霉(Trichodermaviride),Trichodermareesei,Trichodermalongibrachiatum,Myrotheciumverrucaria,黑曲霉(Aspergillusniger),米曲霉(Aspergillusoryzae),Phanaerochaetechrysosporium,粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa),Neocallimastixpartriciarum和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)。
另一种令人感兴趣的真菌纤维素酶是中性或者碱性纤维素酶,它们来源于下组真菌或可由下组真菌产生曲霉属
(Aspergillus),青霉属(Penicillium),毁丝霉属(Myceliophthora),腐质霉属(Humicola),耙菌属(Irpex),镰孢属(Fusarium),Stachybotrys,帚霉属(Scopulariopsis),毛壳属(Chaetomium),疣孢霉属(Mycogone),轮枝孢属(Verticillium),漆斑菌属(Myrothecium),Papulospora,粘帚霉属(Gliocladium),头孢霉属(Cephalosporium)和顶孢霉属(Acremonium),例如选自Humicolainsolens,尖镰孢(Fusafiumoxysporum),嗜热毁丝霉(Myceliopthorathermophila),微紫青霉(Penicilliumjanthinellum),优选的是选自Humicolainsolens,DSM1800,尖镰孢,DSM2672,嗜热毁丝霉,,以及Cephalosporiumsp.,RYM-202的真菌。
其它兴趣纤维素酶是纤维素酶的变体,其母本酶是真菌或者细菌来源的纤维素酶,例如可由真菌腐质霉属(Humicola),木霉属(Trichoderma)或者镰孢属(Fusarium)的菌株产生纤维素酶。
氧化还原酶按照本发明的方法适合结晶的氧化还原酶包括过氧化物酶和氧化酶,如漆酶。
,这些酶的片段也显示过氧化物酶活性。
通过本发明的方法适合结晶的过氧化物酶,是适宜由微生物(如真菌或细菌)产生的过氧化物酶。一些优选的真菌包括属于半知菌亚门(Deuteromycotina),丝孢菌纲(Hyphomycetes)的菌株,例如,镰孢属(Fusarium),腐质霉属(Humicola),木霉属(Tricoderma),漆斑菌属(Myrothecium),轮枝孢属(Verticillum),Arthromyces,卡尔黑霉属(Caldariomyces),Ulocladium,Embellisia,枝孢属(Cladosporium)或者Dreschlera,特殊是尖镰孢(Fusariumoxysporum)vertiginous(DSM2672),Humicolainsolens,Trichodermaresii,Myrotheciumverrucana(IFO6113),黄萎轮枝孢(Verticillumalboatrum),大丽花轮枝孢(Verticillumdahlie),Arthromycesramosus(FERMP-7754),Caldariomycesfumaso,Ulocladiumchartarum,Embellisiaalli或者Dreschlerahalodes。
其它优选的真菌包括属于担子菌亚门(Basidiomycotina),担子菌纲(Basidiomycetes)的菌株,例如鬼伞属(Coprinus),展齿革菌属(Phanerochaete),云芝属(Coriolus)或者栓菌属(Trametes),特别是灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)(IFO8371),长根鬼伞(Coprinusmacrorhizus),Phanerochaetechrysosporium(例如NA-12)或者栓菌属(以前称为多孔菌属(Polyporus)),例如杂色栓菌(Trametesversicolor)(例如PR428-A)。