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专利名称:人黑色素瘤细胞相关的长非编码rna的rna干扰靶点rna及用途的制作方法
技术领域:
本发明属于生物医学专业领域,涉及属于人源IncRNA的一种新型IncRNA、其RNA干扰(RNAinterference,RNAi)靶点序列和短发夹RNA(short-hairpinRNA,shRNA)序列、shRNA编码的小分子干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)、编码shRNA的正义及反义链DNA、编码shRNA的真核重组质粒、以及在制备诊断黑色素瘤疾病试剂及制备治疗黑色素瘤疾病药物中的用途。
背景技术:
人体中编码蛋白质的基因大约有2-3万个,仅占人类基因组的2%,其余98%不编码蛋白质的基因组DNA最初被认为是没有功能的,是生物体中的垃圾,通常被称为“垃圾DNA”(junkDNA)。但目前的研究表明,这些垃圾DNA大多可转录产生非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)。根据成熟转录本大小的不同,ncRNA可分为小分子ncRNA(如siRNA、miRNA,piRNA等),中等长度ncRNA(70-200nt)和长ncRNA(longncRNA,IncRNA,彡200nt)。目前,ncRNA领域研究较多的是小分子ncRNA,而对IncRNA的研究还处于起步阶段。由于序列内
部存在过多的终止密码子,IncRNA不能被翻译成蛋白质,他们通常是以RNA转录本的形式行使其生物学功能,如发育过程中的细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡和类固醇代谢等,越来越多的证据表明IncRNA在细胞中起着调控基因表达的重要作用。最近的研究发现IncRNA与细胞的癌变有着极为密切的联系,起肿瘤抑制基因作用的IncRNA表达下降或者缺失会导致肿瘤的发生,已经发现IncRNA与肺癌、非霍杰金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病有关。这些研究结果都表明IncRNA在细胞增殖、分化和癌变中发挥着重要的作用,肿瘤相关IncRNA的发现可能会对肿瘤的诊断及基因治疗产生重大的影响。通过大范围分析肿瘤和正常组织的IncRNA,可以鉴定与肿瘤特异相关的IncRNA,使其成为潜在的病理诊断标记。通过引入针对具有癌基因特性的IncRNA的shRNA可以有效地表达特异性的siRNA并抑制IncRNA作用的发挥,比其他的治疗手段的毒副作用会更低。相反,通过病毒载体或质粒载体过表达具有肿瘤抑制基因作用的IncRNA,进而抑制其调控的特定靶基因的表达,也可以达到抑制肿瘤生长的效果。因此,发现肿瘤特异性表达的IncRNA对基于IncRNA的肿瘤诊断和治疗具有十分重要的意义。
发明内容
恶性黑色素瘤是一种产生黑色素的高度恶性肿瘤。恶性黑色素瘤多发于欧美白
种人,发病率占全部恶性肿瘤的_3%,但呈明显上升趋势,针对恶性黑色素瘤的诊断和治疗的生物分子的发现具有重要的应用价值。本发明的目的是提供一种人黑色素瘤细胞相关相关的长非编码RNA(longnon-codingRNA,IncRNA)-lncRNA_HN3、其RNA干扰(RNAinterference,RNAi)靶点RNA和短发夹RNA(short-hairpinRNA,shRNA)、shRNA编码的小分子干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)、编码shRNA的正义及反义链DNA及转录shRNA的重组质粒;本发明的再一目的是提供所述人黑色素瘤细胞相关的IncRNA及shRNA、siRNA和转录shRNA的重组质粒的用途。本发明以人恶性黑色素瘤细胞yusac为材料进行与PSF蛋白结合的IncRNA分子的筛选、克隆及分析。采用分子生物学常规技术,从yusac细胞分离获得总RNA,逆转录得到总cDNA并构建yusac细胞的总cDNA文库;通过原核表达及亲和纯化得到带组氨酸标签的His-PSF融合蛋白;用T7RNA聚合酶将cDNA文库中的cDNA插入片段体外转录为RNA混合体;通过组氨酸标签将His-PSF融合蛋白固定于钴离子亲和层析柱上,并将RNA混合体反复过柱,使能够与PSF蛋白结合的RNA吸附于树脂上;将RNA从树脂上洗脱后,经逆转录构建cDNA子文库,文库中富集了编码与PSF蛋白结合的RNA的克隆。挑选文库中的克隆测序,获得基因片段的核酸序列。经过序列分析,我们共得到了数十条
RNA分子。经Blast比对及生物信息学分析,发现一条长236nt的IncRNA序列,其编码序列位于HN基因的3’端转录非编码区(UntranslatedRegions,UTR),命名为lncRNA_HN3。此IncRNA序列通过RT-PCR及测序的方法获得证实,并构建了这条IncRNA的质粒表达载体。针对获得的IncRNA序列,找到了RNAi的靶点序列,构建了表达shRNA序列的质粒载体,当其被导入哺乳动物细胞后可转录产生shRNA,shRNA分子在细胞内通过酶加工后形成成熟的并发挥RNAi功能的siRNA。最后,对此IncRNA序列及对应的shRNA序列对人黑色素瘤细胞的恶性生长的影响进行了分析。本发明所提供的IncRNA序列克隆自人恶性黑色素瘤细胞yusac,定量PCR检测结果表明此IncRNA在恶性黑色素瘤组织中高表达,而在癌旁组织中低表达。构建lncRNA-HN3的质粒表达载体,并转染人黑色素瘤细胞yusac,结果表明lncRNA-HN3在黑色素瘤细胞中的过表达能明显刺激黑色素瘤细胞的恶性生长。构建lncRNA-HN3的shRNA质粒表达载体,并转染人黑色素瘤细胞yusac,结果表明在黑色素瘤细胞中表达lncRNA-HN3对应的shRNA能明显降解细胞内源性lncRNA-HN3并抑制黑色素瘤细胞的恶性生长。基于上述工作本发明得以完成。具体地说,本发明所提供了一种人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA(lncRNA-HN3),其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO1所示,或与序列表中SEQIDNO1
所示的核苷酸序列具有90%以上同源性,或为序列表中SEQIDN01所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。基于上述人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA,本发明提供的lncRNA-HN3的RNA干扰(RNAi)靶点,其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示,或与序列表中SEQIDNO2所示的核苷酸序列90%以上同源性,或为序列表中SEQIDNO:2所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的序列核苷酸。基于上述lncRNA-HN3RNA干扰(RNAi)靶点,本发明提供的RNAi的短发夹RNA(shRNA),其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:3所示,或与序列表中SEQIDNO:3所示的核苷酸序列90%以上同源性,或为序列表中SEQIDN0:3所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的序列核苷酸。本发明提供的人黑色素瘤细胞相关的的长非编码RNA的RNA干扰靶点的小分子干扰RNA(siRNA),其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:4所示,或与序列表中SEQIDNO4所示的核苷酸序列90%以上同源性,或为序列表中SEQIDNO:4所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的序列核苷酸。对于上述短发夹RNA(shRNA)的编码正义链DNA和反义链DNA,所述正义链DNA其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO5所示,或与序列表中SEQIDN05所示的核苷酸序列90%以上同源性,或为序列表中SEQIDNO:5所示核苷酸序列经硫代修饰得到的序列核苷
酸;所述反义链DNA其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:6所示,或与序列表中SEQIDNO:6所示的核苷酸序列90%以上同源性,或为序列表中SEQIDNO6所示核苷酸序列经硫代修饰得到的序列核苷酸。本发明所述转录短发夹RNA的真核重组质粒,由编码人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA的RNA干扰靶点的shRNA的正义链DNA和反义链DNA退火后形成的双链DN***段与真核表达载体构建而成。本发明所提供的人源lnCRNA-lnCRNA-HN3的编码DNA序列定位于人线粒体基因组2710-2945位核苷酸。本发明提供的IncRNA序列,IncRNA的RNAi靶点序列,IncRNA的RNAi靶点的shRNA序列,RNAi靶点shRNA编码的siRNA序列,及编码shRNA的DNA序列既可通过生物学方法获得,又可通过化学合成方法获得,若通过化学合成方法制备,只要将其核苷酸序列提供给有关专业公司,委托其合成即可。为增强其稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征,可对其进行硫代修饰或甲氧基修饰等。本发明提供的人黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA(lncRNA-HN3),包括与其90%以上同源的核苷酸序列,或经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列,可用于制备诊断黑色素瘤疾病的试剂,并且,其RNAi靶点、RNAi靶点shRNA序列及其表达载体、RNAi靶点shRNA编码的siRNA可用于制备治疗黑色素瘤疾病的药物。例如以其单独或混合形式为有效组分配制成非肠道给药制剂,依据给药模式、受者年龄、体重、疾病程度等以适量剂
量给药;也可以采用基因治疗的方法,以质粒或腺病毒为表达载体,使其在癌变部位高效表达。
图1是定量PCR检测本发明所述lncRNA-HN3在人恶性黑色素瘤组织及癌旁组织中表达的结果图。图2是对单克隆黑色素瘤细胞株yuSaC-lnCRNA-HN3和转入空真核表达载体pcDNA--。图3是将单克隆黑色素瘤细胞株yuSaC-lnCRNA-HN3和转入空真核表达载体pcDNA--,图中,1-1和1-2为第1只裸鼠的移植瘤,2-1、2-2为第2只裸鼠的移植瘤,3-1、3-2为为第3只裸鼠的移植瘤。图4是本发明所述lncRNA-HN3在对照细胞株yusac-shLUC和稳定低表达细胞株yusac-shHN3中的表达情况图,图中,1泳道为lncRNA_HN3在对照细胞株yusac-shLUC中的表达,2泳道为lncRNA-HN3在稳定细胞株yusac_shHN3中的表达。图5是对稳定细胞株yusaC-shHN3和对照细胞株yusac-shLUC进行软琼脂集落生长检测的结果图。图6是将稳定细胞株yusaC-shHN3和对照细胞株yusac-shLUC注入裸鼠后的实验结果图,图中,1-1和1-2为各实验组中第1只裸鼠的移植瘤,2-1,2-2为各实验组中第2只裸鼠的移植瘤,3-1、3-2为各实验组中第3只裸鼠的移植瘤。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步说明。下属实施例中,凡未注明具体实验条件的,均为按照本领域技术人员熟知的常规条件,例如Sambrook等著的分子克隆实验室手册(NewYorkCoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989),Freshney著的动物细胞培养基本技术指南第五版(Johnffiley&Sons,Inc,2005)中所述的条件及实验步骤,或按照制造厂商所建议的条件及实验步骤。实施例1:lncRNA_HN3的克隆与分析1、试剂Trizol试剂购自美国Invitrogen公司;匪LV逆转录酶、DNA聚合酶、pfu酶、NdeI酶、XhoI酶、RNase抑制剂均购自立陶宛Fermentas公司;T7RNA聚合酶购自美国NEB公司;随机引物购自美国Promega公司;TAL0N金属离子树脂购自美国BDClontech公司;PCR引物由Invitrogen公司合成。2、菌株、细胞株和载体人恶性黑色素瘤细胞yusac购自美国标准菌种收藏所(ATCC);;PCR-blunt-TOPO载体购自美国Invitrogen公司;pET_28a(+)载体购自德国Novagen公司。3、)人恶性黑色素瘤细胞yusac培养至75%汇合度,加入lmLTrizol试剂,用枪头吹打混勻;2)用5mL1次性注射器吹打10次进行勻浆,将勻浆样品在室温孵育5min;3)***仿,盖紧Ep管盖,用手振荡15s
并于室温孵育2-3min;4)41,12,000\8离心15111土11;5),,颠倒混勻,将混勻后的样品于室温孵育lOmin;6)4°C,12,000Xg离心lOmin。倒掉上清液,用75%的乙醇lmL洗涤RNA沉淀1-2次,旋涡振荡混合样品后,4°C,7,500Xg离心5min;
7)倒掉乙醇,常温干燥RNA沉淀lOmin,加入50yL无RNA酶的H20,并于55°C孵育5min,以使RNA充分溶解,于260nm测定RNA浓度。(RT)在500iiLEP管中加入以下组分yusac细胞RNA10uL随机引物(10umol/L)1uLH2018UL混勻后70°C温育5min,迅速置冰浴中,静置3min后加样如下
RNase抑制剂1iiLdNTP(1Ommo1/L)1uL5X逆转录酶缓冲液8iiLMMLV逆转录酶1iiL混勻后42°C温育lh,70°ClOmin灭活逆转录酶,_20°C保存样品。(操作步骤见DNA聚合酶、pfu酶操作手册)。所得平末端双链cDNA连接到PCR-blunt-TOPO载体上,构建yusac细胞总cDNA文库。-(PCR)扩增PSF基因的编码序列(CodingSequence,CDS)反应体系为PCR缓冲液(10X)5uLMgCl2(
/L)()(10iimol/L)(10iimol/L)-PSF(连接位点为EcoRI和EcoRV)(5U/uL)(5U/uL)°Clmin(预变性);94V30sec(变性),65V30sec(复性),72°C2min(延伸),所述变性_复性_延伸23个循环;72°ClOmin(终延伸)。引物序列如下上游引物(FP):5,ATATTACCATATGTCTCGGGATCGGTTCCGG-3,(下划线标示NdeI酶切位点)下游引物(RP):5,-GGGCTCGAGCTAAAATCGGGGTTTTTTGTT-3,(下划线标示XhoI酶切位点)-PSF融合蛋白的原核表达载体的构建将PSF的编码序列通过NdeI和XhoI酶切位点克隆到原核表达载体pET_28a(+)的多克隆位点区,得到重组质粒pET-28a(+)-PSF(载体多克隆位点区末端自带组氨酸His标签)。-PSF融合蛋白的原核表达1)-28a(+);2)接种转化了重组质粒pET-28a(+)(含50i!g/ml卡那霉素)中,37°C震荡培养;3)检测菌液0D6(-,并将温度调至25°C,诱导培养过夜。
-PSF融合蛋白的亲和纯化1)离心收集菌体,菌体经