与植物耐热性相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法.docx

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专利名称::与植物耐热性相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域:
:本发明涉及一种与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用,特别是涉及一种与植物耐热性相关的蛋白及其编码基因rs6^5T与应用。
背景技术:
:随着全球人口的增加,对粮食的需求日益增加。作为世界范围内主要的粮食作物,小麦是一种喜凉的C3作物,最适生长温度为23°C—25°C,高温在我国主要麦区使小麦减产10%—20%,是小麦生产中的重要限制因素,特别是生育后期的高温胁迫严重影响了小麦的产量和品质,给人们的生活带来了很大的影响。因此,如何提高小麦的耐热性,探索小麦耐热性的机理,开发耐热相关基因,并将它们应用到小麦育种,从而培育出耐热品种己经成为当今农业科学领域中的重要课题。GA(赤霉素)调节蛋白GAST是受GA调节并与细胞生长有关的基因。到目前为止,已在不同的植物中如拟南芥、非洲菊、矮牵牛、水稻、马铃薯等克隆了20多个GAST1同源基因,他们编码的蛋白的氨基酸同源性在50%—80%之间(Herzog等,1995)。被称为GASTs多基因家族。并且拟南芥中的GAST家族成员GASA4超表达提高了植株的耐热性,而在小麦中有关该家族成员的研究开展极少。
发明内容本发明的目的是提供一种与植物耐热性相关的蛋白及其编码基因。本发明所提供的与植物耐热性相关的蛋白,名称为7^A5T(7^'fic咖aes^'K腿6^'A/;t),来、源于普iS/J、麦(7>jYic〃/aesfin/fflL.),是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐热性相关的由l)衍生的蛋白质。为了使l)中的7^W5T[更于纯化,可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKUSEEDL上述2)中的7^;A5T可人工合成,也可先合成编码基因,再进行生物表达得到。上述2)中的73《A5T的编码基因可通过将序列表中序列1自5'末端第696-992位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变,和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述与植物抗逆性相关蛋白的DNA基因也属于本发明的保护范围。与植物耐热性相关的蛋白的咖
A基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第696-992位脱氧核糖核苷酸;2)其核苷酸序列是序列表中的序列l;3)在严格条件下与序列表中序列1的自5'末端第696-992位脱氧核糖核苷酸杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子;4)与l)或2)的基因具有90X以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。序列表中的序列1由1059个碱基组成,其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第696-992位碱基,编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的7^fi45T蛋白。(),,在DNA或者RNA杂交实验中65i:下杂交并洗膜。序列表中的序列1由1059个脱氧核苷酸组成。自5'端第1位至695位脱氧核苷酸为启动子区,自5'端第696位至992位脱氧核苷酸为编码框序列,编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。自5'端第993位至1059位脱氧核苷酸为3'端非翻译区序列。序列表中的序列2由98个氨基酸残基组成,含有GAST家族保守结构域GASA(序列2的自氨基端第37位至98位氨基酸残基)。序列表中,下划线表示GASA结构域,红色部分表示形成结构域的保守氨基酸。扩增上述rsW5T基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。含有上述与植物耐热性相关蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。其中,上游引物和下游引物之间的距离在
50到5000个碱基之间;该引物对中的每一个引物的长度为15到30个碱基。如,引物l:引物l:5'-GACCAGGATGAGCAAGCCAT-3,;引物2:5'-GTGGAGTAGAGGTTGAAGAAGCC-3'。使用化W6T基因构建重组表达载体时,可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子,如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等,它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用;此外,使用本发明的基因构建植物表达载体时,还可使用增强子,包括翻译增强子或转录增强子,这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等,但必需与编码序列的阅读框相同,以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所用植物表达载体进行加工,如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑,可不加任何选择性标记基因,直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体具体可为在植物表达载体pCAMBIA-1300的多克隆位点间插入上述与植物耐热相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体,如
pCAMBIA-35S-7^W5T。本发明的另一个目的是提供一种培育耐热性提高的转基因植物的方法。本发明所提供的培育耐热性提高的转基因植物的方法,是将上述与植物耐热性相关蛋白的编码基因7^AST导入植物中,得到耐热性提高的转基因植物。所述与植物耐热性相关蛋白的编码基因73^5T是通过所述重组表达载体导入植物中的。携带有本发明的与植物耐热性相关蛋白编码基因ra^6T的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主可以是水稻、小麦、拟南芥、非洲菊、矮牵牛或马铃薯等。本发明提供的植物耐热相关蛋白rsfii5T及其编码基因对于培育抗逆性提高的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义,可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。图1为rs^5T基因在各种胁迫处理后的表达量。图2力7^7A5T基因在热处理(HS)和赤霉素处理(GA)条件下的动态表达模式。其中,A:赤霉素处理;B:热处理;C:赤霉素和热处理共同进行,横坐标为处理时间,纵坐标为基因的相对表达量。图3为7^A5T基因在热处理(HS)和赤霉素处理(GA)条件下的在小麦品系中国春和T扁107中的表达模式。其中,CK为对照,,后期为48h,横坐标为处理条件,纵坐标为基因的相对表达量。图
4为转73"5T基因株系和转空载体株系在45。C高温胁迫前后的表型。其中,A:5tt处理前照片B:5#处理后照片C:8#处理前D:8tt处理后E:13#处理前F:13共处理后G:5tt处理后的放大图片H:8井处理后的放大图片I:13#处理后的放大图片。具体实施例方式下述实验方法,如无特别说明,均为常规方法。实施例l、7i^AST基因的克隆(1)小麦ra6"A:r基因序列的电子克隆根据AffymetrixGenechipwheatGenomearray所给出的探针号为""的探针序列,在NCBI()网站上进行Blast比对,得到与之高度同源的小麦EST序列,下载这些EST序列,将结果中有部分重叠的序列用DNAMAN软件的sequenceassembly程序进行拼接,得到了具有起始密码子和终止密码子的ORF拼接序列。利用GeneBank中的tblastx验证该片段编码的氨基酸序列是否含有预测的功能域,针对ORF设计PCR特异引物,并进行扩增。所用引物对为5,-GACCAGGATGAGCAAGCCAT-3,禾B5,-GTGGAGTAGAGGTTGAAGAAGCC-3'。(2)小麦raa5T基因启动子克隆小麦TaGAST基闲启动子的克隆,釆用BDGenomeWalker试剂盒(Clontech,CA,USA),具体过程按说明书进行。其基因内部的引物设计为Jl-l:5'--GATAAATTCAGACAGTACCGCTC--3'和J2—2:5'—GAAATATTTTCTTTACCAGCCCGGGC-_3'。全序列信息见序列分析表中的序列
1,登录Plantcare(http:〃/)网站对该区域所包含的顺式作用成分进行了分析,见表l。表lTaGAST启动子区域所包含的顺式作用元件及其数目tableseeoriginaldocumentpage6TC-richr印eats防御和胁迫应答元件1ABREABA应答元件3CGTCA-motif茉莉酸甲酯响应元件1TGACG-motif茉莉酸甲酯响应元件1MBSMYB转录因子结合位点1实施例2、7^7AST基因的胁迫诱导表达模式以20%聚乙二醇(PEG-6000)胁迫、250mM***化钠(NaCl)盐胁迫、100uMHA氧化胁迫处理,以及植物激素ACC200ixM胁迫、ABA100uM胁迫、MeJA100yM胁迫、赤霉素(GA)胁迫和热(HS)胁迫等分别处理小麦品种TAM107(TriticumaestivumL.)和中国春(ChineseSpring,)生长十天的幼苗,并取不同处理时间的小麦叶片,提取RNA反转录cDNA后,用引物l:5,-CCACCGTCTCAAGTCTCAAC-3,和弓l物2:5'-ACAGGCAGCMACTCACTC-3,。采用实时荧光定量PCR检测7^fiiS7基因的时空表达特征。其中胁迫处理的具体方法为如下热处理和赤霉素处理同时将2个小麦材料移入①4(TC光照培养箱进行热处理(HS);②GA(正常温度,20mg/L)处理;③HS(40。C)和GA(20mg/L)共同处理。、1h、2h、12h后迅速剪取叶片放入液氮中速冻,-70'C保存备用。高盐(NaCl)处理在培养瓶中加入NaCl溶液至终浓度为250mM。聚乙二醇
(PEG-6000)处理在培养瓶中加入PEG-6000溶液至终浓度为20%(质量百分含量)。植物激素ABA处理把ABA(分析纯,购自Sigma-aldrich)溶解在DMSO中制成lOmM贮存液,然后加入到培养瓶中至终浓度为100uM。植物激素ACC处理把ACC(购自Sigmal公司)溶解在水中制成10mM母液,然后加到培养瓶中至终浓度200uM。植物激素MeJA处理吸取一定体积的MeJA(分析纯,购自Sigma-aldrich)加入水中制成lOmM母液,然后加入到培养瓶中至终浓度IOOW。氧化处理吸取一定体积的30%的HA(购自北京化工厂)加入水中制成100uM的工作液。在加入上述溶液以后,分別在处理O、、1、6、12小时选取小麦的叶片,迅速置于液氮中,于-8(TC冰箱中保存,待用。其中O小时的样品为每种处理的对照CK,同时以未处理的小麦叶片(即只生长在水中),作为对光周期响应的对照组。rs^45T基因在转录水平上受ABA、ACC、MeJA、H202、PEG-6000和NaCl处理的诱导。从图1可以看出在植物激素ABA处理后中国春(CS)中ra^5T基因的表达量随着处理时间的延长逐渐升高到最高水平;TAM107中7^6^5T基因在12h才达到最高水平。乙烯前体ACC的处理后,中国春中rs6^ST基因的表达在处理的初期()迅速增加到最高水平,然后随着处理时间的延长表达量下降;TAM107中化fi45T基因在2h时达到最高水平而后下降。MeJA处理初期(),中国春中7^AST基因的表达量迅速增加到最高水平,随后一直保持下降趋势;
T旭107中7^A5T基因的表达量在12h才达到最高水平。氧化胁迫HA处理后中国春中7afi45T基因的表达量在2h增加到最高水平,随后迅速下降,TAM107中7^,在12h才达到最高水平。干旱胁迫PEG处理后,中国春中7a6^5T基因在处理的初期()表达到最高水平;TAM107中7^M6T基因的表达量在12h才达到最高水平。高盐NaCl处理时,中国春和TAM107中ra^45T基因表达量都在lh时升到最高,然后开始下降,中国春中表达量下降较剧烈,TAM107中表达量下降较缓慢。从图2中可以看出中国春中7^《A5T基因在仅赤霉素处理(GA)时,48h时才有较高表达量;TAM107中rsW5T基因一直保持一定的较低水平,到48h升高到较高的表达量。仅热处理(HS)时,,随后下降;,然后下降到后期48h时,表达量依然高于本底水平。在热处理(HS)和赤霉素处理(GA)同时进行时,中国春7^,后稍有些起伏,到24h达到最高,后迅速下降;TAM107中基因表达量随着处理时间的延长升高,,随后迅速下降,表达量维持在较高的稳定水平直到后期48小时。图3中可以看出中国春中73^57基因在前期(L5h)仅热胁迫处理条件下表达量最高,热胁迫和赤霉素GA同时处理的条件下表达量较高;后期
(48h)GA处理的表达量最高,其他处理的表达量维持在较低水平。TAM107中前期()73fA5T基因表达量在赤霉素GA处理、热胁迫处理和赤霉素与热胁迫同时处理条件下依次增高;后期(48h)GA处理的表达量最高,其他处理的表达量维持在较低水平。实施例3、野生型和转基因植物在高温胁迫处理条件下的表型及生理鉴定1、转基因植株的获得(1)pCAMBIA-35S-TaGAST表达载体的构建以小麦品种TAM107(7Wti,se^i丽L.)叶片的cDNA为模板,利用引物3:5,-GCTCTAGAATGGCGCAGCGGGATCACA-3,和5,-GGGGTACCTCAGAACCTGACGAGCTTG-3',PCR扩增得到包含7^A5T编码序列(序列表中序列1的自5'端第696位至992位脱氧核苷酸)的核苷酸序列,将得到的7^^ST片段经限制性内切酶Z力3l和^Ml消化后,插入质粒pCAMBIA-1300(购自CAMBIA公司)的限制型内切酶和《如I酶切位点之间,得到含有7s^5T编码区片段的表达载体pCAMBIA-TaGAST;以限制性内切酶III和J力aI消化质粒pBI121(购自Clontech公司),回收CaMV35S片段,并插入质粒pCAMBIA-TaGAST(购自CAMBIA公司)的限制型内切酶历'"dIII和Jfel酶切位点之间,得到含有CaMV35S启动子和7^fi45T编码区片段的超表达载体pC纖IA-35S-TaGAST。用pCAMBIA-35S-TaGAST转化根癌农杆菌GV3101(菌种购自上海坤肯生物化工有限公司),利用农杆菌侵染方法转化Col咖bia生态型拟南芥(购自拟南芥生物资源中心