厩腐蝇分子标准样品及其制备方法.docx

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专利名称:厩腐蝇分子标准样品及其制备方法
技术领域:
本发明涉及厩腐蝇分子标准样品及其制备方法和应用,属于卫生检疫技术研究领域。
背景技术:
国内外关于媒介生物分子DNA标准样品的研究则尚处于起步的阶段,很多问题都亟待解决。由于受生物发育阶段的限制以及近缘种生物形态的相似性、实际工作中样品的不完整性等原因,传统的形态学手段进行物种鉴定遇到很多实际困难。现有分子DNA技术被证明是一个行之有效的生物鉴定手段。目前,我国还没有经过国家认可的、统一的、规范化的厩腐蝇分子DNA标准样品,在国际上也没有该类标准样品。因此,本项目研制的厩腐蝇标准样品将为厩腐蝇分子鉴定工作提供参照和依据,为我国分子标准样品的研究工作起到一定的推动作用。
发明内容
本发明目的是提供厩腐蝇分子标准样品,均勻性稳定性良好,另外本发明还提供标准样品的制备方法,工艺简单,易于制备。本发明厩腐蝇分子标准样品,以野外采集厩腐蝇成虫通过实验室条件饲养后,提取高纯度DNA,进行分装、冻干,得到厩腐蝇的分子标准品,其具有下述的理化性质(1)形状纯白色粉末状;
(2);(3)DNA纯度0D260/280=;(4)易溶于水或TE(Tris-EDTA)缓冲液中。所述DNA纯度0D260/280=。本发明厩腐蝇分子标准品的制备方法,包括以下步骤厩腐蝇分子标准样品的制备方法,其特征在于包括如下步骤
第一步、厩腐蝇DNA提取野外采集厩腐蝇成虫,在实验室条件下饲养,提取厩腐蝇DNA,采用试剂盒提取DNA
(1)用研磨棒进行勻浆
取广IOOmg的厩腐蝇组织移入冰浴预冷的离心管中,用研磨棒快速研磨成糊状;;
加入350μ的SolutionI将研磨棒上的勻浆冲入离心管中,充分振荡混合后,65°C保温5分钟;
(2)加入400μ的SolutionII,振荡混合;
(3)加入ImL的4°C预冷的SolutionIII,充分混勻后,12,000rpm离心2分钟;
(4)弃去上层有机相,再加入ImL的4°C预冷的SolutionIII,充分混勻后,12,000rpm离心2分钟;
(5)弃去上层有机相,然后将水相溶液(无色下层)转移至置于离心管上的滤杯中,12,000rpm离心1分钟;(注有机相(上层)带有颜色,请务必除尽,否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上,相见沉淀不用考虑,在过滤时将被去除。)
(6)弃滤杯,在滤液中加入400μ的DB缓冲液,混合均勻;
(7)试剂盒中的旋转柱安置于离心管上。将上述操作6混合溶液转移至旋转柱中,12,000rpm离心1分钟,弃滤液;
(8)将500μ的RinseA加入至旋转柱中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液;
(9)将700μ的RinseB加入至旋转柱中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液;(注
请确认RinseB中已经加入指定体积的100%乙醇。请沿旋转柱管壁四周加入Rinse
B,这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。)
(10)重复操作步骤(9);
(11),在旋转柱膜的中央处加入5(Γ200μ的灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液,室温静置1分钟。(注把灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至65°C使用时有利于提高洗脱率。)
(12)12,000rpm离心1分钟洗脱DNA;_20°C保存备用;第二步、核酸标准样品的制备
,每种核酸分子标样分装150管,然后冻干,即为目的标准品。所述对制得的标准样品进行定性鉴定,通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析,来确认所制备的核酸为目的DNA;取制备的核酸标准样品,加入50μΤΕ,溶解后作为模板使用,经采用特异性引物
28SrRNA-l和28SrRNA_2进行PCR并测序,进行定性分析,确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品;
上游引物5’-GACTACCCCCTGAATTTAAGCAT-3,下游引物5’-GACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAG-3,反应体系




反应条件
940C5min94°C30s50°C30s
72°C2min循环35次
72°C7min。本发明厩腐蝇分子标准样品以野外采集厩腐蝇成虫通过实验室条件饲养后,提取高纯度DNA,进行分装、冻干,得到厩腐蝇的分子标准品,其具有的理化性质佳可采用特异性引物通过PCR方法检测,灵敏度达到10_3倍。该标准品作为阳性参照物质,适用于出入境卫生检疫部门及其他行业,可用于对厩腐蝇的检测鉴定,提高鉴定结果的准确性。四
图1是厩腐蝇总DNA电泳图。图2是特异性引物扩增电泳结果图,图中1-6为目的DNA。图3是灵敏度实验结果图,图中由左到右,每一格为一个浓度,依次是10、IO"2,IO"3,IO"4,1(Γ5
。五具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明,但本发明并不局限于具体实施例。实施例1
厩腐蝇分子标准样品的制备方法,按如下步骤进行
第一步、厩腐蝇DNA提取野外采集厩腐蝇成虫,在实验室条件下饲养,提取厩腐蝇DNA,采用试剂盒提取DNA
(1)用研磨棒进行勻浆
取广IOOmg的厩腐蝇组织移入冰浴预冷的离心管中,用研磨棒快速研磨成糊状;加入350μ的SolutionI(宝生物工程(大连)有限公司产品);
加入350μ的SolutionI将研磨棒上的勻浆冲入离心管中,充分振荡混合后,65°C保温5分钟;
(2)加入400μ的SolutionII(宝生物工程(大连)有限公司产品),振荡混合;
(3)加入ImL的4°C预冷的SolutionIII,充分混勻后,12,000rpm离心2分钟;
(4)弃去上层有机相,再加入ImL的4°C预冷的SolutionIII(宝生物工程(大连)有限公司产品),充分混勻后,12,000rpm离心2分钟;
(5)弃去上层有机相,然后将水相溶液(无色下层)转移至置于离心管上的滤杯中,12,000rpm离心1分钟;(注有机相
(上层)带有颜色,请务必除尽,否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上,相见沉淀不用考虑,在过滤时将被去除。)
(6)弃滤杯,在滤液中加入400μ的DB缓冲液,混合均勻;
(7)试剂盒中的旋转柱安置于离心管上。将上述操作6混合溶液转移至旋转柱中,12,000rpm离心1分钟,弃滤液;
(8)将500μ的RinseA加入至旋转柱中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液;
(9)将700μ的RinseB加入至旋转柱中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液;(注
请确认RinseB中已经加入指定体积的100%乙醇。2)请沿旋转柱管壁四周加入RinseB,
这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。)
(10)重复操作步骤(9);
(11),在旋转柱膜的中央处加入5(Γ200μ的灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液,室温静置1分钟。(注把灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至65°C使用时有利于提高洗脱率。)
(12)12,000rpm离心1分钟洗脱DNA;_20°C保存备用;第二步、,每种核酸分子标样分装150管,然后冻干,即为目的标准品,其具有下述的理化性质(1)形状纯白色粉末状;(2)每管含量^;(3)DNA
纯度:0D260/280=;(4)易溶于水或TE(Tris-EDTA)缓冲液中;
第三步、取制备的核酸标准样品,加入50μΤΕ,溶解后作为模板使用,经采用特异性进行PCR并测序,进行定性分析,确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品例上游引物5’-GACTACCCCCTGAATTTAAGCAT-3,下游引物5’-GACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAG-3,反应体系




反应条件
940C5min;94°C30s,50°C30s,72°C2min,35cycles;72°C7min。实施例2
对上述制得的标准样品进行DNA完整性、均勻性、稳定性测试(一)DNA质量及完整性检测取制备的DNA,进行凝胶电泳、纯度及浓度检测;
(I)DNA完整性检测直接法-用提取的DNA直接电泳检查,120V,%琼脂糖凝胶电泳,观察条带的完整性,检测结果见图1,条带完整,无弥散状,说明DNA条带完整性较好。(2)DNA浓度及纯度检测紫外分光光度计法-吸取1μLDNA用分光光度计测定260nm和280nm的吸收值,然后根据
0D26(1/0D28(1值判断DNA纯度,并根据OD26tl计算其浓度。按以下公式计算
DNA浓度(ng/μL)=,表示RNA含量较高;当OD260/OD280=,表示DNA较纯。(二)标准样品均勻性分析
为检查制备的目的核酸标准样品的均勻性,采用PicoGreenDNA分子荧光定量方法及紫外分光光度法,取随机抽取15管样品,每管样品分成2份子样进行测试,结果见(表1)数据进行F检验(表2)确认样品均勻性。(三)标准样品稳定性分析本有证标准样品参考国外同等带证有证标准样品的稳定性期限规定说明(在真空、避光、-2Q°C下贮存,稳定有效期为两年)为依据,其生物特性,以2年为期,对制备的标准样品分阶段每次取二份样品,按照不同保存条件进行定性测定,每份样品以测定3次值为其定值结果。在全部稳定性测试中,所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均勻性测试相同。依据上述测定方法分别计算结果,本厩腐蝇分子标准样品在真空、避光、-2Q°C下贮存,稳定有效期为2年,测定结果见表3。斜率可用下式计算
权利要求
,其特征在于以野外采集厩腐蝇成虫通过实验室条件饲养后,提取高纯度DNA,进行分装、冻干,得到厩腐蝇的分子标准品,其具有下述的理化性质(1)形状纯白色粉末状;
(2);(3)0嫩纯度00260/280=;(4)易溶于水或TE(Tris-EDTA)缓冲液中。
,其特征在于DNA纯度0D260/280=。
,其特征在于包括如下步骤第一步、厩腐蝇DNA提取野外采集厩腐蝇成虫,在实验室条件下饲养,提取厩腐蝇DNA;第二步、,每种核酸分子标样分装150管,然后冻干,即为目的标准品。
,其特征在于第一步、提取厩腐蝇DNA,具体步骤是(1)用研磨棒进行勻浆取广IOOmg的厩腐蝇组织移入冰浴预冷的离心管中,用研磨棒快速研磨成糊状;;加入350μ的SolutionI将研磨棒上的勻浆冲入离心管中,充分振荡混合后,65°C保温5分钟;(2)加入400μ的SolutionII,振荡混合;(3)加入ImL的4°C预冷的SolutionIII,充分混勻后,12,000rpm离心2分钟;(4)弃去上层有机相,再加入ImL的4°C预冷的SolutionIII,充分混勻后,12,000rpm离心2分钟;(5)弃去上层有机相,然后将水相溶液转移至置于离心管上的滤杯中,12,000rpm离心1分钟;(6)弃滤杯,在滤液中加入
400μ的DB缓冲液,混合均勻;(7)试剂盒中的旋转柱安置于离心管上,将上述操作(6)混合溶液转移至旋转柱中,12,000rpm离心1分钟,弃滤液;(8)将500μ的RinseA加入至旋转柱中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液;(9)将700μ的RinseB加入至旋转柱中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液;(10)重复操作步骤(9);(11),在旋转柱膜的中央处加入5(Γ200μ的灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液,室温静置1分钟;(12)12,000rpm离心1分钟洗脱DNA;_20°C保存备用。
,其特征在于对制得的标准样品进行定性鉴定,通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析,来确认所制备的核酸为目的DNA;取制备的核酸标准样品,加入50μΤΕ,溶解后作为模板使用,经采用特异性引物28SrRNA-l和28SrRNA_2进行PCR并测序,进行定性分析,确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品;上游引物5’-GACTACCCCCTGAATTTAAGCAT-3,下游引物5’-GACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAG-3,,反应条件·940C5min·94°C30s·50°C30s·72°C2min循环