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专利名称:油菜茎基溃疡病菌分子标准样品及其制备方法
技术领域:
本发明涉及油菜茎基溃疡病菌分子标准样品,另外本发明还涉及其制备方法,属于植物检疫技术研究领域。
背景技术:
国内外关于动物病毒及食品微生物标准物质的报道甚多,而植物病原菌的标准物质研究则刚刚起步,很多问题都亟待解决。国内外植物病原菌检测时多购买美国菌种保藏中心(ATCC)的菌株作为阳性对照,其价格非常昂贵,国内几乎无法购买到,而植物病原菌分子检测的分子DNA标准物质鲜见相关研究报道,所以全面深入的研究解决植物病原菌检测DNA标准样品的制备技术和稳定性保证技术,积极开展我国植物检疫性病原菌检测分子DNA标准样品的研制,添补该测量领域的空白,具有很重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供油菜茎基溃疡病菌分子标准样品及其制备方法和应用说明。本发明油菜茎基溃疡病菌分子标准样品,以油菜茎基溃疡病菌菌株提取高纯度DNA为原料制得,标准样品具有下述的理化性质(1)形状纯白色粉末状;(2)每管的含量5μδ士0.;(3)DNA纯度:0D260/280=;(4)易溶于水,或TE(Tris-EDTA)缓冲液中。所述DNA纯度
0D260/280=。本发明油菜茎基溃疡病菌分子标准样品的制备方法,包括如下步骤
(1)油菜茎基溃疡病菌菌株采用马铃薯蔗糖(PD)液体培养基,置于2022°C条件下培养57天;
(2)提取油菜茎基溃疡病菌DNA,采用CTAB方法提取DNA;
(3),每种核酸分子标样分装100-400管,然后冻干,即为目的标准品。所述提取油菜茎基溃疡病菌DNA,包括如下步骤
①,在液氮中迅速研磨成粉末状,(同时做多管);
②向①中装有干菌丝粉末的离心管中加入800μ65°C预热的CTAB提取缓冲液,涡旋振荡充分混勻,65°C水浴50min,每隔10min轻轻颠倒混勻一次;
③冷却至室温,再向②中离心管加入800μ1的***仿异戊醇混合液(体积比为M:1),轻轻颠倒混勻,静置10min,40C10000rpm离心10min,取上清;
④向③中所得上清液中加入与该上清液等体积的***仿异戊醇混合液(体积比为M1),轻轻颠倒混勻,静置10min,40C10000rpm离心10min,取上清;
⑤向④中所得上清液中加入与该上清液等体积的异丙醇或2倍体积冰无水乙醇,轻轻颠倒混勻,出现DNA絮状沉淀,放在冰上放
置30min沉淀DNA,4°C12000rpm离心10min,弃上清,离心管倒置滤纸上干燥,用800μ1浓度70%冰乙醇清洗沉淀两次,以除去盐离子等。加入800μ1浓度70%冰乙醇后,轻轻颠倒离心管几次,将沉淀于底部的DNA弹起,放置离心管10min,4°C10000rpm离心1min,弃上清;再用800μ1浓度70%冰乙醇洗DNA沉淀,方法同上,4°C15000rpm离心3min,弃上清,风干去除乙醇;
⑥向⑤中所得DNA沉淀中加入200μ1TE溶解DNA沉淀。待充分溶解后,加入3μ1RNase(10mg/ml),37°C水浴30min;然后按③一⑤步相同处理方法进行处理;
⑦将第⑥步处理后的干燥DNA沉淀,用100μTE溶解,-20°C保存备用。所述对标准样品定性鉴定,通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析,来确认所制备的核酸为目的DNA
取制备的核酸标准样品,加入50μ1ΤΕ,溶解后作为模板使用,经采用特异性引物PhomI和WlomII进行PCR并测序,进行定性分析,确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品,
正向引物5'-CACCAATTGGATCCCCTA-3,
反向引物5,-AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA-3,
反应体系

反应条件
940C3min94°C30s53°C30s
72°C40s循环;35次
72°C5min。本发明油菜茎基溃疡病菌分子标准样品以实验室自行分离的油菜茎基溃疡病菌菌株为原料,通过特定条件大量培养,提取高纯度DNA,进行分装、冻干,得到油菜茎基溃疡病菌的分子标准品,理化性质优异,可采用特异性的引物通过PCR方法检测出,灵敏度达到10_4倍。经检测试验,该标准品DNA完整性、均勻性、稳定性好,可用于进出口检测中,作为阳性参照物质,提高检测结果的准确性。四
图1是油菜茎基溃疡病菌总DNA电泳图。图2是油菜茎基溃疡病菌特异性引物扩增电泳结果图,其中1、2、3为目的DNA。图3是本发明标准样品灵敏度检测结果图,其中由左到右,每两格为一组,依次是IO"1,IO"2,10_3,10_4,10_5。五具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明,但本发明并不局限于具体实施例。实施例1
油菜茎基溃疡病菌分子标准样品制备方法按如下步骤进行
(1)油菜茎基溃疡病菌菌株采用马铃薯蔗糖(PD)液体培养基,置于2022°C条件下培养57天。(2)提取油菜茎基溃疡病菌DNA,采用CTAB方法提取DNA,具体步骤如下
①,在液氮中迅速研磨成粉末状,(同时做多管);
②向①中装有干菌丝粉末的离心管中加入800μ65°C预热的CTAB提取缓冲液,涡旋振荡充分混勻,65°C水浴50min,每隔10min轻轻颠倒混勻一次;
③冷却至室温,再向②中离心管加入800μ1的***仿异戊醇混合液(体积比为M:1),轻轻颠倒混勻,静置10min,40C10000rpm离心10min,取上清;
④向③中所得上清液中加入与该上清液等体积的***仿异戊醇混合液(体积比为M1),轻轻颠倒混勻,静置10min,40C10000rpm离心10min,取上清;
⑤向④中所得上清液中加入与该上清液等体积的异丙醇或2倍体积冰无水乙醇,轻轻颠倒混勻,出现DNA絮状沉淀,放在冰上放置30min沉淀DNA,4°C12000rpm离心10min,弃上清,离心管倒置滤纸上干燥,用800μ170%冰乙醇清洗沉淀两次,以除去盐离子等。加入800μ170%冰乙醇后,轻轻颠倒离心管几次,将沉淀于底部的DNA弹起,放置离心管10min,4°C10000rpm离心1min,弃上清;再用800μ170%冰乙醇洗DNA沉淀,方法同上,40C15000rpm离心3min,弃上清,风干去除乙醇;
⑥向⑤中所得DNA沉淀中加入200μ1TE溶解DNA沉淀。待充分溶解后,加入3μ1RNase(10mg/ml),37°C水浴30min
;然后按③一⑤步相同处理方法进行处理;
⑦将第⑥步处理后的干燥DNA沉淀,用100μTE溶解,-20°C保存备用。(3)核酸标准样品的制备将测定浓度后的DNA按管进行分装,每种核酸分子标样分装150管,然后冻干,即为目的标准品,具有下述的理化性质形状纯白色粉末状;每管的含量士0·5μδ;DNA纯度:0拟60Λ80=;易溶于水,或TE(Tris-EDTA)缓冲液中。(4)取制备的核酸标准样品,加入50μ1ΤΕ,溶解后作为模板使用,经采用特异性进行PCR并测序,进行定性分析,确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品。例
正向引物5'-CACCAATTGGATCCCCTA-3,
反向引物5,-AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA-3,
反应体系

940C3min;94°C30s,53°C30s,72°C40s,35cycles;72°C5min。实施例2
对实施例1制得的标准样品进行DNA完整性、均勻性、,进行凝胶电泳、纯度及浓度检测。(I)DNA完整性检测直接法-用提取的DNA直接电泳检查,120V,%琼脂糖凝胶电泳,观察条带的完整性,检测结果见图1,条带完整,无弥散状,说明DNA
条带完整性较好。(2)DNA浓度及纯度检测紫外分光光度计法-吸取1μ1DNA用分光光度计测定260nm和280nm的吸收值,然后根据0D26(1/0D28(1值判断DNA纯度,并根据OD26tl计算其浓度。按以下公式计算
DNA浓度(ng/μD=,表示RNA含量较高;当OD260/OD280=,表示DNA较纯。
为检查制备的目的核酸标准样品的均勻性,采用PicoGreenDNA分子荧光定量方法及紫外分光光度法,取随机抽取15管样品,每管样品分成2份子样进行测试,结果见(表1)数据进行F检验(表2)确认样品均勻性。
本有证标准样品参考国外同等带证有证标准样品的稳定性期限规定说明(如美国SIGMA公司生产规定说明,该有证标准样品在真空、避光、-20°C下贮存,稳定有效期为两年)为依据,根据微生物的生物特性,以2年为期,对制备的标准样品分阶段每次取二份样品,按照不同保存条件进行定性测定,每份样品以测定3次值为其定值结果。在全部稳定性测试中,所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均勻性测试相同。依据上述测定方法分别计算结果,本油菜茎基溃疡病菌标准样品在真空、避光、-2Q°C下贮存,稳定有效期为2年,测定结果见表3。
稳定性试验中,斜率可用下式计算
^i(Xi-X)(Yi-Y)Ii1=J=L---=-
Z(Xi-I)2
3-1
式中f==:b0=F-^1X=
权利要求
,其特征在于以油菜茎基溃疡病菌菌株提取高纯度DNA为原料制得,标准样品具有下述的理化性质(1)形状纯白色粉末状;(2)每管的含量±0.;(3)DNA纯度0拟60Λ80=;(4)易溶于水,或TE(Tris-EDTA)缓冲液中。
,其特征在于DNA纯度0D260/280=。
,其特征是包括如下步骤(1)油菜茎基溃疡病菌菌株采用马铃薯蔗糖(PD)液体培养基,置于2022°C条件下培养57天;(2)提取油菜茎基溃疡病菌DNA,采用CTAB方法提取DNA;(3),每种核酸分子标样分装100-400管,然后冻干,即为目的标准品。
,其特征是所述提取油菜茎基溃疡病菌DNA,包括如下步骤
①,在液氮中迅速研磨成粉末状,;②向①中装有干菌丝粉末的离心管中加入800μ65°C预热的CTAB提取缓冲液,涡旋振荡充分混勻,65°C水浴50min,每隔10min轻轻颠倒混勻一次;③冷却至室温,再向②中离心管加入800μ1的***仿异戊醇混合液,轻轻颠倒混勻,静置10min,40C10000rpm离心10min,取上清;④向③中所得上清液中加入与该上清液等体积的***仿异戊醇混合液,轻轻颠倒混勻,静置10min,40C10000rpm离心10min,取上清;⑤向④中所得上清液中加入与该上清液等体积的异丙醇或2倍体积冰无水乙醇,轻轻颠倒混勻,出现DNA絮状沉淀,放在冰上放置30min沉淀DNA,4°C12000rpm离心10min,弃上清,离心管倒置滤纸上干燥,用800μ1浓度70%冰乙醇清洗沉淀两次,以除去盐离子等;加入800μ1浓度70%冰乙醇后,轻轻颠倒离心管几次,将沉淀于底部的DNA弹起,放置离心管10min,4°C10000rpm离心1min,弃上清;再用800μ1浓度70%冰乙醇洗DNA沉淀,方法同上,4°C15000rpm离心3min,弃上清,风干去除乙醇;⑥向⑤中所得DNA沉淀中加入200μ1TE溶解DNA沉淀;待充分溶解后,加入3μ1RNase(10mg/ml),37°C水浴30min;然后按③一⑤步相同处理方法进行处理;⑦将第⑥步处理后的干燥DNA沉淀,用100μTE溶解,-20°C保存备用。
,其特征是对标准样品定性鉴定,通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析,来确认所制备的核酸为目的DNA取制备的核酸标准样品,加入50μ1ΤΕ,溶解后作为模板使用,经采用特异性引物PhomI和WlomII进行PCR并测序,进行定性分析,确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品,正向引物5'-CACCAATTGGATCCCCTA-3,反向引物5,-AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA-3,°C30s53°C30s72°C40s循环;35次72°C5min。
,其特征是所述提取油菜茎基溃疡病菌DNA中采用的***仿异戊醇混合液体积比为M:1。
全文摘要
本发明涉及属于植物检疫技术研究领域。油菜茎基溃疡病菌分子标准样品。油菜茎基溃疡病菌分子标准样品,以油菜茎基溃疡病菌菌株提取高纯度DNA为原料制得,标准样品具有下述的理化性质(1)形状纯白色粉末状;(2)每管的含量5μg±;(3)DNA纯度OD260/280=~2;(4)易溶于水,或TE(Tris-EDTA)缓冲液中。本发明油菜茎基溃疡病菌分子标准样品以实验室自行分离的油菜茎基溃疡病菌菌株为原料,通过特定条件大量培养,提取高纯度