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专利名称:番茄溃疡病菌分子标准样品及其制备方法
技术领域:
本发明涉及番茄溃疡病菌分子标准样品,另外本发明还涉及其制备方法,属于植物检疫技术研究领域。
背景技术:
国内外关于动物病毒及食品微生物标准物质的报道甚多,而植物病原菌的标准物质研究则刚刚起步,很多问题都亟待解决。国内外植物病原菌检测时多购买美国菌种保藏中心(ATCC)的菌株作为阳性对照,其价格非常昂贵,国内几乎无法购买到,而植物病原菌分子检测的分子DNA标准物质鲜见相关研究报道,所以全面深入的研究解决植物病原菌检测DNA标准样品的制备技术和稳定性保证技术,积极开展我国植物检疫性病原菌检测分子DNA标准样品的研制,添补该测量领域的空白,具有很重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供番茄溃疡病菌分子标准样品,均勻性和稳定性佳,另外本发明还提供其制备方法,工艺简单,易于操作。本发明番茄溃疡病菌分子标准样品,
番茄溃疡病菌分子标准样品的制备方法,具体步骤是
(1)番茄溃疡病菌菌株按常规细菌进行菌株活化、增菌培养,26°c培养24h;
(2)提取番茄溃疡病菌DNA,采用preman法提取DNA
①取新鲜培养的相应致病菌增菌液ImL于2mL离心管中;
②以13000r/min离心3min,吸弃上清;
③加入100μLDNA提取液;
④震荡混勻后(没有细菌菌块)沸水浴lOmin,13000r/min离心;3min;
⑤-20°C备用。(3)标准样品的制备
将测定浓度后的DNA按管进行分装,每种核酸分子标样分装150管,然后冻干,即为目的标准品。本发明制得的标准样品进行定性分析实验,具体是取制备的核酸标准样品,加入50μ1ΤΕ,溶解后作为模板使用,经采用特异性进行PCR并测序,进行定性分析,确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品。例
正向弓I物5'-tcattggtcaattctgtctccc-3’反向弓I物5,-tactgagatgtttcacttcccc-3,PCR扩增PCR扩增釆用25μL体系,如下
权利要求
,其特征在于以分离的番茄溃疡病菌菌株为原料提取高纯度DNA,进行分装、冻干,得到番茄溃疡病菌的分子标准品,其具有下述的理化性质(1)形状纯白色粉末状;(2);(3)DNA纯度
:0D260/280=;(4)易溶于水,或TE(Tris-EDTA)缓冲液中。
,其特征在于DNA纯度0D260/280=。
,其特征是包括如下步骤(1)番茄溃疡病菌菌株按常规细菌进行菌株活化、增菌培养,26°C培养24h;(2)提取番茄溃疡病菌DNA,采用preman法提取DNA;(3)DNA质量及完整性检测、DNA浓度及纯度检测;(4)标准样品的制备将测定浓度后的DNA按管进行分装,然后冻干,即为目的标准品。
,其特征是制备的标准样品定性鉴定取制备的标准样品,加入50μ1ΤΕ,溶解后作为模板使用,经采用特异性引物进行PCR并测序,进行定性分析,确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品;正向弓丨物(F)5'-tcattggtcaattctgtctccc-3,反向弓I物(R)5'-tactgagatgtttcacttcccc-3,PCR扩增PCR扩增采用25μL体系,(5μΜ)°C预变性3min,94°C变性30s,°C退火45s,72°C延伸30s,30个循环,最后72°C延伸5min;按上述条件将该病菌进行特异性引物的PCR扩增,扩增后,可产生片断
250bp左右的片断,表明该病菌即为番茄溃疡病菌。
,其特征是所述提取番茄溃疡病菌DNA,具体步骤是(1)番茄溃疡病菌菌株按常规细菌进行菌株活化、增菌培养,26°C培养Mh;(2)提取番茄溃疡病菌DNA,采用preman法提取DNA①取新鲜培养的相应致病菌增菌液ImL于2mL离心管中;②以13000r/min离心3min,吸弃上清;③加入100μLDNA提取液;④震荡混勻后(没有细菌菌块)沸水浴lOmin,13000r/min离心;3min;⑤-20°C备用。
全文摘要
本发明涉及番茄溃疡病菌分子标准样品,另外本发明还涉及其制备方法,属于植物检疫技术研究领域。番茄溃疡病菌分子标准样品,以分离的番茄溃疡病菌菌株为原料提取高纯度DNA,进行分装、冻干,得到番茄溃疡病菌的分子标准品,其具有下述的理化性质(1)形状纯白色粉末状;(2)每管的含量5±;(3)DNA纯度OD260/280=~2;(4)易溶于水,或TE(Tris-EDTA)缓冲液中。本发明标准样品可采用特异性的引物通过PCR方法检测出,灵敏度达到10-4倍。该标准品可用于进出口检测中,作为阳性参照物质,提高检测结果的准确性。