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生物药物分析复习
第一章绪论
药物分析的性质:应用化学,物理化学和生物化学的方法和技术对药物的质量进行全面控制的学科。
药物分析的任务:药物研制过程中的“眼睛”;制定药物质量标准;生产过程中的质量控制;开展临床药学研究;常规
药品的检验。
*药品质量标准:国家对药品质量及检验方法所做的技术规定。是药品生产,经营,使用以及检验和监督管理部门共
同遵循的法律依据。
*中国药典的内容:凡例,正文,附录,索引。
药检工作基本程序:取样,鉴定,检查,含量测定,书写检查报告。
酶法分析(终点法,酶循环放大分析法,速度法)是利用酶作为工具对特定物质(底物、辅酶、抑制剂和激动剂等)
进行定量分析的方法。
终点法(总变量法)测定原理:先借助酶反应(单个酶反应或几种酶构成的偶联酶反应)使被测物定量的进行转变,
然后在转变完成后,测定底物,产物或辅酶物质的变化量,因此称为终点法。
终点法的条件:,并能得到它的制品;2能够确定使这种酶反应接近进行完全的
条件;;
件的情况下,最好是采用单一酶反应就能进行定量检测。使用终点法测定应注意的问题:酶的底物的专一性(最好是
绝对专一性);反应的平衡;反应液中的酶量;反应产物的抑制。
终点法的种类
(一)单酶反应定量法:
1、底物减少量的测定:胞嘧啶(280nm)、腺嘌呤(280nm)和尿酸(293nm或297nm)。
:(1)各种氨基酸和草酸(2)黄嘌呤、次黄嘌呤以及CoA
**(理解例子学会如何进行实验设计和分析)
条件:测定以NAD或NADP为辅酶的脱氢酶的底物的量。
原理:NADH和NADPH在340nm有特征最大吸收峰,而NAD和NADP在340nm却无这一吸收带,故可应用于NAD或NADP
为辅酶的脱氢酶反应,通过测定340nm吸光度的变化,就可以对作用相应脱氢酶底物的物质进行定量分析。
(二)和指示酶反应偶联的定量法
(理解例子学会如何进行实验设计和分析)
酶循环放大分析法具有化学放大作用,理论上可无限放大其灵敏度。是利用酶循环设计的一种超微分分析法。
步骤:转换反应,循环反应,指示反应
转换反应:以试样中的待测组分为底物,经特异反应生成与待测组分相当的定量循环底物。
循环反应:生成的循环底物反复参加由两个酶反应组成的偶联反应,所得产物量为循环底物的若干倍。
指示反应:采用酶法测定反应产物。由反应产物量及循环次数,计算出循环底物量,再推算出试样中待测组分的量。
酶循环放大分析法应用范围
(NAD、NADP、CoA)
(GATPHK)
酶循环放大分析应该注意的问题:
,必须完全除去转换反应中剩余的辅酶;
(不是辅酶)必须过量;
免疫分析——利用抗原抗体反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的方法。
抗原与抗体性质及其相互作用
免疫球蛋白分子由两条重链(H链)和两条轻链(L链)通过不同数目的二硫键结成Y形。在抗体分子的N端为“多变
区”(V区),是抗体分子与抗原决定簇的结合部位;抗体分子的C端为“稳定区”(C区),是抗体抗原特异性部位。
抗原抗体结合具有高度特异性。抗原的特异性取决于抗原决定簇的数目、性质和空间构型,而抗体的特异性则取决
于抗体IgFab段的可变区与相应抗原决定簇的结合能力。抗原与抗体通过很弱的短矩引力而结合,如范德华引力、
静电引力、氢键及疏水性作用等。
免疫扩散技术
基本原理:可溶性的抗原和相应的抗体在溶液或凝胶中彼此接触,形成不溶性抗原-抗体复合物沉淀。
双向免疫扩散基本原理:指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散,彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。
如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统,则小孔间可出现两条以上的沉淀线。
双向免疫扩散的应用:、抗体相对含量测定;、抗体相对分子量分析
酶免疫分析技术基本原理:指酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应。它采用抗原与抗体的特异反应与酶连
接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定。
酶联免疫吸附试验(ELISA):结合在固相载体上的抗原(抗体)与待检抗体(抗原)酶偶联物(标记物)反应后,
催化水解或氧化还原酶的相应底物呈色,其颜色深浅与待测抗原(抗体)含量成正比。:.
包被
:指将抗原或抗体固相化的过程。它是通过物理吸附作用,一般靠疏水键连接。
封闭:指用封闭剂封闭经包被的固相载体表面残留的未饱和位吸附位点的过程。
常规使用的ELISA技术主要有:
直接ELISA:测抗原间接ELISA:测抗体夹心ELISA:测抗原竞争ELISA:测抗体或抗原及半抗原
反向捕捉ELISA:测特异性IgM单位点非竞争ELISA:主要测半抗原细胞ELISA:测细胞表面抗原
夹心ELISA
•基本原理:样品中抗原与载体上抗体结合,经洗涤加入该抗原的酶标记抗体,洗去未结合的酶标抗体,加底
物显色,可定量测定抗原。
•双抗体夹心法测抗原:应用针对抗原两个不同决定族的两种单抗分别作为固相载体包被和酶标抗体,以检测
相应的抗原。此法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原。
•双抗原夹心法测抗体:用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同
之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。
•此法适用于多价大分子抗原(血清中HBsAg、AFP和尿液hCG)的检测,而不能用于测定半抗原等小分子物质。
竞争ELISA
•竞争法测抗体:待测抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。当抗原材料中的干扰物质不易除去,或
不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体。
竞争法测抗原:待测抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合,结果如待测抗原含量越多,与固相抗体结合的酶
标抗原就越少,显色越浅,二者呈负相关。
放射免疫测定RAI基本原理:放射性标记的已知抗原(*Ag)和非标记的待检抗原(Ag)同时与限量的特异性抗体
进行竞争结合或竞争性抑制反应,通过测定结合(*Ag-Ab)的或游离(*Ag)的放射性标记抗原的量,根据标准曲
线即可推算出被测物含量的一种超微量分析技术。
免疫放射分析(IRMA)基本原理:用过量的核素标记抗体与待测抗原形成复合物,并用固相免疫吸附剂作为B
或F的分离手段除去多余的游离抗体,测量抗原抗体复合物的放射性。
放射免疫与免疫放射原理的区别
IRMA与RIA的工作原理的主要区别
项目RIA(放射免疫)IRMA(免疫放射)
反应机制竞争性反应非竞争性全量反应灵敏度提高(10-100倍)
反应试剂三种标记抗原二种标记抗体
分离方法抗原只需一个抗原决定簇一般需单抗作分离剂,抗原需两个或两个以上决
定簇
待测抗原复合物与待测抗原呈负相关与待测抗原呈正相关
放射性
非特异性结合主要影响高剂量反应主要影响低剂量反应
待检抗原性质半抗原及大分子蛋白质、酶等生物大分子
ELISA操作要点:
•加样:即加标本、酶结合物和底物,注意交叉污染和产生气泡。
•温育:常采用的温度:43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)。
•洗涤:是ELISA最主要的关键技术,目的是分离游离的和结合的酶标记物。洗涤方式自动板机、手工操作(浸
泡式和流水冲洗式)。
•显色:影响因素:反应温度和时间;OPD底物液应避光显色,硫酸终止;TMB显色终止液:叠氮钠、SDS、各
类酸性终止液。
比色:以蒸馏水校零点,测读底物孔(未经任何反应仅加底物液的孔)和空白孔(以生理盐水或稀释液代替
标本作全过程的孔)。
*生物检定是利用生物体包括整体动物、离体组织/器官、细胞和微生物等评估药物生物活性的一种方法。它以药物
的药理作用为基础,以生物统计为工具,运用特定的实验设计在一定条件下比较供试品和相当的标准品或对照品
所产生的特定反应,通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生物反应程度,从而测定供试品的效价、生物活
性或杂质引起的毒性。
生物检定的作用:
生物检定法具有独到的优势,主要表现在:
(1)直接关切生化药物的有效性和安全性;
(2)量效关系确切,可为临床用药剂量的规范化提供参考;
(3)是反映产品质量的重要指标,具有专属性。
生物检定在药物分析中的应用:1、药物的效价测定;2、大分子结构的测定;3、微量生理活性物质的测定;4、药物:.
的毒性成分及有害杂质的限度检查;5、新药研究。
电泳技术的基本原理
电泳:带电粒子在电场中的定向移动。
在电解质溶液中,位于电场中的带电离子在电场力的作用下,以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象,
称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同,迁移速率不同,可实现分离。
电泳法:指带电微粒如蛋白质、核苷酸、其他微粒分子或离子在电场的作用下,向其对应的电极方向按各自的速度泳
动而使组分分离,再进行检测或计算百分含量的方法。
颗粒在溶液中迁移的驱动力:颗粒的有效电荷和电位梯度。
影响电泳速度的因素:颗粒性质;电场强度;溶液性质;电渗;焦耳热;筛孔:
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理:以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶为支持物,采用电泳基质的不连续体系(即凝胶层、缓
冲液离子成分、PH、电位梯度均不连续),使样品在不连续的两层凝胶之间积聚浓缩成很窄的样品区带(
米),然后再进行分离,从而提高了分辨率。
PAGE不连续系统的原理与技术
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种物理效应:样品的浓缩效应;分子筛效应;电荷效应。
样品的浓缩效应:①凝胶孔径不连续性②缓冲液离子成份的不连续性③PH的不连续性④电位梯度的不连续性
*三种物理效率使样品分离效果好,分辨率高。
⑴一般电泳分离的电荷效应:带电多,MW小,迁移快
⑵不连续系统对样品的浓缩效应:迁移率,被压成薄层
⑶凝胶对样品分子的筛选效应
影响蛋白质与SDS的结合程度的因素:溶液中SDS单体的浓度;样品缓冲液的离子强度;二硫键是否完全被还原
SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理和技术
十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂,能使蛋白质的氢键和疏水键打开,并结合到蛋白质分子上,形成蛋
白质—SDS复合物。蛋白质带上相同密度的负电荷;SDS与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变;凝胶电泳中的
迁移率,不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,只与蛋白质分子量相关。蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分
子量大小,而与所带电荷和形状无关。
影响迁移率的因素:⑴二硫键是否完全被还原;⑵溶液中SDS的浓度;⑶溶液的离子强度
等电聚焦电泳(IEFE)是一种利用具有pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。
等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电解质,当通以直流电时,两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增
加的pH梯度,在此体系中,不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上,也就是说被聚焦于一个狭的区带
中。
*理想的载体两性电解质应具备的特征:
①分子量要小,以便与被分离大分子物质分离;
②化学性质稳定;
③各成分的pI彼此接近,并在其pI值附近有良好的缓冲能力;
④在pI处具有足够的电导,导电性均匀;
⑤两性电解质载体的数目要足够多;
⑥可溶性好;
⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度,不干扰样品的测定。
高效毛细管电泳HPCE:是以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,根据样品各组分之间迁移率和分配行为
的差异,而实现分离的一种新型电泳技术。
双向电泳:将样品进行电泳后,为了不同的目的在它的垂直方向再进行一次电泳的方法。双向电泳的种类:第一向
等电聚焦,第二向SDS电泳第一向SDS电泳,第二向等电聚焦。常用的双向电泳为第一向等电聚焦,第二向SDS电泳。
,如_范德华引力_、_静电引力__、_氢键_及__疏水性作用__等。
(药物、激素、蛋白质、微生物等)的方法。
,使标本中非标记抗原与试剂中标记抗原竞争结合抗体,通
过测定结合相的放射性强度,推定标本含量。
,先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体,再用酶
免疫、放射免疫等技术测定。
5.*标准品是指用于生物检定、抗生素或生物药品中含量或效价测定的标准物质,以效价单位(U)表
示。
,聚合反应所使用的化学催化剂是过硫酸铵TEMED
光聚合催化剂是__核黄素__。
。
,在电场中向正极移动。
色谱分析:.
按操作形式分类:纸色谱,薄层色谱,柱色谱.
纸色谱:以纸为载体,纸上所含水分或其他物质为固定相,用展开剂进行展开的分配色谱.
纸色谱的影响因素:1滤纸的影响2展开剂的影响3物质极性的影响4pH的影响5温度和时间的影响
薄层色谱选择吸附剂的原则
(1)样品组分的性质
(2)吸附剂的性质①根据薄层色谱的分离机制,选择适宜活性的吸附剂。②吸附剂对样品的作用:③薄层的显色方
法不同,所用的吸附剂也不同。④吸附剂的规格
对展开剂的要求
(1)能够溶解待测组分;
(2)能使待测组分与杂质分开;
(3)-;
(4)不能与待测组分或吸附剂发生化学反应;
(5)具有适中的沸点和比较小的粘度;
(6)展开后组分的斑点圆且集中;
(7)混合溶剂最好临用前新鲜配制
薄层色谱法常见的问题和消除的方法:(一)斑点拖尾现象(二)边缘效应(三)S形及波浪形斑点(四)斑点呈念珠状(五)
展速慢(六)Rf值不稳定
N=16(tr/w)2=(tr/w1/2)2
HETP=A+B/v+Cv
分子筛的优缺点?
,所需设备简单。
,重复性高。最突出的是样品回收率高,接近100%。
。
。适用于各种生化物质,如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。
分离的分子量范围也很宽。
,分离操作较慢。对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外,凝胶层析要求样品粘度不宜
太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。
:
检测器的类型紫外检测器;荧光检测器;示差折光检测器;蒸发光散射检测器;质谱检测器;电导检测器;PH检
测器。
蒸发散射质量检测器的优缺点:
1与示差折光检测器相比:灵敏度高;对流动相系统温度变化不敏感;可进行梯度洗脱.
2与光吸收检测器相比:能解决最困难的HPLC检测问题。如磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸
收系数很小的化合物的检测;减低流动相溶剂的纯度要求;无需测定定量校正因子.
亲和色谱也称为亲和层析,是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。
原理:将一对能可逆结合和解离生物分子的一方最为配基(也称为配体),与具有大孔径、亲水性的固相载体
相偶联、制成专一的亲和吸附剂,再用此亲和吸附剂填充色谱柱,当含有被分离物质的混合物随着流动相流经
色谱柱时,亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质,而其他的蛋白质及杂质不被吸附,从色谱
柱中流出,使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附,即可获得纯化的目的产物。
高效液相色谱基本仪器装置:输液系统,进样系统,分离系统,检测系统,数据处理系统。
容量因子:是指在分配“平衡”后,组分在固定相中的质量与在流动相中质量的比值。也称为质量分配系数。
拖尾因子:T=。-,,。
质谱分析法(massspectrometry):将化合物形成离子和碎片离子,按其质荷比(M/Z值)的不同进行分离测定,来进行
成分和结构分析的一种分析方法。
蛋白质质谱:是通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比
值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值,分析鉴定已知或未知蛋
白质。
质谱仪至少由以下四部分组成:
进样系统——按电离方式的需要,将样品送入离子源的适当部位;
离子源——用来使样品分子电离生成离子,并使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束;:.
质量分析器——利用电磁场(包括磁场、磁场和电场的组合、高频电场和高频脉冲电场等)的作用将来自离子源的
离子束中不同质荷比的离子按空间位置,时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离;
检测器——用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。
离子源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大,因此,
对于不同的分子应选择不同的离解方法。
硬电离方法——能给样品较大能量的电离方法
软电离方法——给样品较小能量的电离方法,该方法适用于不稳定或易电离的样品。
电喷雾离子化技术(electrosprayionization,ESI)
利用强静电场从溶液直接产生气态离子化分子的电离方式。ESI可以与液相色谱、高效液相色谱、毛细管IEF以及毛
细管电泳等多种进样器联用。
ESI-MS特点
优点:解决了极性大、热不稳定的蛋白质与多肽分子的离子化和大分子质量、一级结构和共价修饰位点的测定问题,
并可用于研究DNA与药物、金属离子、蛋白质和抗原与抗体的相互作用。
缺点:样品中的盐类对样品结果影响很大,而且单个分子带电荷不同可形成多种离子分子峰(重叠峰),所以对混合物
的图谱解析比较困难。
基质辅助激光解析电离(matrix-assistedlaserdesorptionionization,MALDI)
待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质(matrix)混合,此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行
挥发,样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中,样品然后置于激光离子发生器(lasersource)。激
光作用于样品混合物,使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽,使之由固态样品混合物变成气
态。
MALDI-MS特点
对于一些分子量较大(>1000000Da)或疏水性强的蛋白质,MALDI比ESI更有效。
MALDI能有效地分析较复杂的肽混合物或物理化学性质相差较大的蛋白质混合物。只要能与所选择的底物形成稳定
的分散体系的样品都能用MALDI进行分析。
MALDI不受样品所含的添加物、缓冲液或盐的影响,且灵敏度也比别的离子化方式高。
核磁共振光谱学.
具有非零自旋量子数的原子核具有自旋角动量,因而也就具有磁矩,例如象1H,31P,13C,
,
,但正是这一微小的差别造就了核磁共振光谱学.
x-射线衍射技术和NMR技术在研究蛋白质空间结构中的优缺点?
x-射线衍射技术
固体状态,可以测定中-大蛋白质结构,技术更成熟;需结晶,经常存在相位问题。
NMR技术
溶液状态,接近生理状态,不需结晶,可研究蛋白质动力学过程,可以较方便地研究蛋白质-配体相互作用;只能测定
小-中蛋白质结构,技术还在发展。
蛋白质类药物分析
来源:天然来源(提取);化学合成或者半合成;现代生物技术制备。
近年来SFDA批准的生物技术药物:干扰素(α1b,α2b,α2a,γ);白细胞介素-11;
重组人胰岛素、重组甘精胰岛素注射液、重组赖脯胰岛素注射液;白细胞介素-2;G-集落刺激因子、GM-集落刺激因子;
肿瘤坏死因子-α;红细胞生成素;链激酶、葡激酶;人、牛碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子。
氨基酸重要化学反应:
*:用于氨基酸定量定性测定.
,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应(sanger反应):用于蛋白质N-:.
(PITC)的反应(Edman反应):•用于蛋白N-端测定,蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。
蛋白质的理化性质:两性解离性质及等电点:蛋白质胶体性质;蛋白质的沉淀;蛋白质的变性与复性;蛋白质的紫
外吸收特性;蛋白质呈色反应。
氨基酸组成分析的步骤:水解,衍生(柱前衍生化和柱后衍生化),色谱
流程:样品——阳离子交换柱——衍生化(茚三酮)——检测
柱后衍生化:将水解后的氨基酸样品经过离子交换柱分离。
原理:,极性,可用阳离子交换树脂在色谱柱上进行吸附,用不同PH和离子强度的缓冲液
依次将它们洗脱;,先洗脱下来;
和力次弱,跟着洗脱下来;,最后被洗脱下来;,
进行定量测定。
蛋白质常用的水解方法:酸性水解(盐酸水解和磺酸水解);碱性水解;酶水解;微波辐射能水解;膜上蛋白质印迹样
品的水解(原位分析)。盐酸水解得到除色氨酸和胱氨酸外的氨基酸;碱性水解得稳定色氨酸。
几种常见的氨基酸分析方法:
1、茚三酮反应
2、荧光胺法
3、邻苯二甲醛(OPA)法
4、PTC-AA分析法
5、Dansyl-Cl(DNS-Cl)法
6、磺酰氯二甲胺偶氮苯(Dabsyl-Cl)法
蛋白质的N-末端的测定
1、二硝基氟苯法(DNFB法、Sanger法)
2、二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-Cl法)
3、异硫氰酸苯酯法(PITC法)
4、DABITC法
5、氨肽酶法
蛋白质的C末端的测定
1、羧肽酶法
2、(LiBH4法,还原法)
3、肼解法
蛋白质二级结构测定:
采用圆二色光谱测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。
蛋白质三级结构测定
X射线衍射法和核磁共振技术是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。
蛋白质纯度检查:非还原SDS-PAGE电泳法和HPLC法(分子筛层析、反相HPLC、离子交换层析等)
蛋白质含量测定
Folin-酚试剂法(Lowry法)、染色法(Bradford法)、双缩脲法、紫外吸收法、HPLC法和凯氏定氮ELISA法考马斯量
蓝G250BCA法(4-甲酸喹啉法)等方法。
凯氏定氮法原理:当蛋白质与浓硫酸共热时,被氧化为二氧化碳和水,而氮转化为氨,氨与硫酸结合成硫酸铵,称
为“消化”。硫酸铜用作催化剂。消化液转入凯氏定氮仪反应室中,加入过量浓氢氧化钠,使硫酸铵分解放出氨,将氨
驱入过量的标准硼酸溶液中,用标准盐酸进行滴定。
双缩脲法原理:蛋白质含有两个以上的肽键。在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物,其颜色的深浅与蛋白质的含
量成正比。540nm比色。
福林酚法原理:蛋白质用碱性铜溶液(酚试剂)处理,使其形成铜蛋白质络合物。该络合物中的酪氨酸,色氨酸能
还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin试剂),产生深蓝色。660nm比色。
蛋白质相对分子质量测定:还原型SDS-PAGE法测定;凝胶过滤(分子筛)法:根据蛋白分子大小和形状进行测
定,误差比SDS-PAGE大;质谱法;梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳。
梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳原理:在梯度凝胶电泳中,蛋白质在电场中向着凝胶浓度逐渐增高的方向即孔径逐渐减
小的方向迁移,随着电泳的继续进行,蛋白质受到孔径的阻力越来越大。在梯度凝胶电泳中,蛋白质的最终迁移位置
仅取决于它本身分子的大小,与蛋白质电荷密度无关。蛋白质的相对迁移率与其分子量的对数在一定范围内呈线性关
系。
肽图常用的分析方法有:(1)SDS-PAGE电泳(2)反相HPLC(RP-HPLC)(3)毛细管电泳(4)液质分析。
糖蛋白的糖基化分析:糖基化位点,分子量,糖的组成,连接方式,
分析方法:酶解,质谱,LC/MS,GC/MS
宿主细胞蛋白含量:双抗体夹心ELISA:.
概念:宿主细胞蛋白质一般简称宿主蛋白,是指生产过程中来自宿主或培养基的残留肽等杂质。基因工程药物中的宿
主蛋白含量,可用ELISA法测定。
测定方法包被;加样;加抗体;检测。
*宿主细胞DNA残留量测定方法概念:供试品中的DNA经变性为单链后吸附与固相膜上,在一定温度下。可与相匹
配的单链DNA复性而重新结合成双链DNA,称为“杂交”。将特异性DNA探针标记后,与吸附在固相膜上的供试品单链
DNA杂交,并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果,与已知含量的阳性DNA对照对比后,可测定供试品中外源性
DNA的含量。
*宿主细胞DNA残留量测定方法:标记;杂交;免疫检测
蛋白质最终产品的控制
*(1)氨基酸组成(2)氨基酸末端序列N-端和C-端氨基酸(3)肽谱(4)巯基和二硫键巯基
和/或二硫键的数量和位置(5)碳水化合物结构中性糖、氨基糖、唾液酸(6)分子量应用分子筛层析法、SDS-PAGE
(还原和/或非还原条件下)、质谱测定法(7)等电点通过等电聚焦电泳或其他适当的方法测定。(8)消光系数(或
克分子吸光度)(9)电泳图型(10)液相层析图谱分子筛层析、反相液相层析、离子交换液相层析、亲和层析获得
目的产品/药物的一致性、同一性和纯度的层析图谱和数据(11)光谱分析
(1)工艺相关杂质(2)产品相关杂质
(1)鉴别试验应用免疫印迹法(2)效价测定(3)特异比活性测定(4)热原质试验(5)无菌试验(6)抗原性物
质检查(7)异常毒性试验
氨基酸定量法:茚三酮法,三硝基苯磺酸法,铜复合物紫外吸收法,甲醛滴定法,非水溶液滴定法,双波长分光光度
法,导数分光光度法,HPLC。
*茚三酮法:茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应,氨基酸被氧化分解生成醛,放出氨和二氧化碳,还原型茚三酮。还
原型茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合生成蓝紫色的物质。最大吸收值波长570nm.
*甲醛滴定法:在PH中性下,甲醛迅速与氨基酸上的氨基结合,使平衡向右移动,促使氢离子释放,使溶液酸度增
加。每释放出一个氢离子,相当有一个氨基酸。(成品测定)
非水溶液滴定法:是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。适合成品测定),有直接滴定法和回滴法。
合成多肽药物类药物分析
化学合成多肽分类:纯天然多肽;经结构修饰的天然多肽;人工设计出的多肽。
制备方法:液相合成和固相合成
液相合成的优点:中间产物纯化、中间产物的理化常数、可以随意进行非氨基酸修饰、可以避免氨基酸缺失。
缺点:是较为费时、费力等。
固相合成优点:是简化了每步反应的后处理操作,避免因手工操作和物料转移而产生的损失,产率较高且能够实现自
动化等。
缺点:是每步中间产物不可以纯化,必须采用较大的氨基酸过量投料,粗品纯度不如液相合成物,必需通过可靠的分
离手段进行纯化等。
液相合成法较适于合成短肽;
固相合成法更适于合成中、长肽。
多肽药物不稳定的原因:水解、氧化、外消旋化、