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生物检测技术及检测试剂盒的制作方法
我国已发展成为世界上最大的养殖大国,畜产品产量约占世界的百分之二十五左右,生猪存栏更是达到世界总量的百分之五十八以上。如何准确快速的进行疾病的检测,以便及时采取有效防治和治疗措施,减少疾病的发生和造成的损失,已成为当前养殖业发展的迫切需求。该发明根据国内外重大动物疫病快速诊断与检测需求及药物残留,非法添加剂的检测需求,针对几种重大动物疫病猪大肠杆菌病、新城疫、高致病性蓝耳病、猪瘟、猪伪狂犬、猪圆环建立不同的检测方法,提高了检测水平与检测效率,市场需求广泛。猪瘟、猪蓝耳病二重RT-PCR快速检测试剂盒、猪伪狂犬病毒-猪细小病毒-猪圆环病毒2型多重PCR检测试剂盒和猪大肠杆菌毒力因子三重PCR等检测试剂盒,同时检测多种疾病,灵敏度高、特异性强。
【专利说明】生物检测技术及检测试剂盒
【技术领域】
[0001]生物检测技术及检测试剂盒属于分子诊断【技术领域】。
【背景技术】
[0002]生物医药产业作为新兴的朝阳行业日益受到我国政府的高度重视。生物检测技术及检测试剂盒的研制技术属分子诊断技术,广泛应用于动物、肉制品、奶制品等方面的检测。
[0003]分子诊断是当代医学发展的重要前沿领域之一,其核心技术是基因诊断,常规技术包括:聚合酶链式反应(PCR),DNA测序(DNAsequencing),荧光原位杂交技术(FISH),DNA印迹技术(DNAblotting),单核苷酸多态性(SNP),连接酶链反应(LCR),基因芯片技术(genechip)。其中,PCR产品占据目前分子诊断的主要市场,基因芯片是分子诊断市场发展的主要趋势。PCR产品灵敏度高、特异性强、诊断期短,可进行定性、定量检测,应用广泛,为早期诊断、早期治疗提供了有效的帮助。基因芯片是分子生物学、微电子、计算机等多学科结合的结晶,综合了多种现代高精尖技术,被专家誉为分子诊断行业的终极产品。但其成本高、开发难度大,目前产品种类很少,只用于科研和药物筛选等用途。
[0004]随着分子生物学技术的不断发展,目前已有多种检测方法和检测试剂盒用于这些传染病的检测。目前最常用的有PCR检测试剂盒、RT-PCR检测试剂盒、实时荧光定量PCR检测试剂盒、ELISA检测试剂盒、LAMP检测试剂盒等。
[0005]PCR:英文全称:polymerasechainreaction,即:聚合酶链式反应。1985年,美国科学家KaryMullis经过两年的努力,发明了PCR技术,并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此,PCR技术得到了生命科学界的普遍认同。
PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断。
[0006]RT-PCR:英文全称是reversetranscriptionPCR,即反转录PCR。它是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断,并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
[0007]酶联免疫吸附试验(ELISA):英文全称是EnzymeLinkedImmunosorbentAssay。是目前应用最广泛的病毒抗原及抗体的检测技术,已经建立了多种方法,如间接法、双抗体夹心法、捕获法和生物素亲和素法等。近年来,在传统ELISA方法的基础上,研究者们对其进一步改进并建立了膜酶免疫试验和微孔膜免疫试验。
[0008]LAMP=NotormT等开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法,即所谓的环一媒恒温扩增法(Loop-MediatedIsothermalAmplification,LAMP),其特点是针对祀基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymemse)在恒温条件(65°C左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应,直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断是否发生反应,肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物。因此,
LAMP技术可用于病原微生物的现场快速检测及基层普及应用。
[0009]环介导等温扩增反应(loop-mediatedisothermalamplification),LAMP法是用一套四条特异性引物与靶基因的六个不同区域退火杂交,在具有链置换活性功能的DNA聚合酶的作用下实现等温条件下扩增DNA分子的核算扩增新技术。
【发明内容】
[0010]本项目组根据国内外几种重大动物疫病猪大肠杆菌病、新城疫、高致病性蓝耳病、猪瘟、猪伪狂犬、猪圆环快速诊断与检测需求建立不同的检测方法。
[0011](I)PCR检测方法
①RT-PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction)即逆转录PCR,是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应(PCR)相结合的技术。[0012]②多重PCR(multiplexPCR):一般PCR仅应用一对引物,通过PCR扩增产生一个核酸片段,主要用于单一致病因子等的鉴定。多重PCR是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物,某些遗传病及癌基因的分型鉴定。
[0013]③荧光定量PCR:是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。
[0014]PCR技术路线:荧光定量PCR(荧光标记探针)一单一PCR(—对引物)一D或cDNA—变性一退火一延伸(N次循环进行变性到延伸的操作)
多重PCR(两对以上引物)一延伸一产物电泳一获得检测结果一分析。
[0015]⑵酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedTmmunoSorbentAssay),,特异性强,重复性好的实验诊断方法
将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来,可敏感地检测体液中微量的特异性抗体或抗原。
[0016]间接ELISA技术路线:
抗原的包被(4°C包被过夜、洗涤3次)一封闭(37°C孵育2h,洗涤3次)一待测血清(37°C孵育lh,洗涤3次)一酶标二抗(37°C孵育lh,洗涤3次)一显色一终止,酶标仪测定OD值
⑶LAMP法
环介导等温扩增反应(loop-mediatedisothermalamplification),LAMP
法是用一套四条特异性引物与靶基因的六个不同区域退火杂交,在具有链置换活性功能的DNA聚合酶的作用下实现等温条件下扩增DNA分子的核算扩增新技术,具有高特异性、高效率、便捷等特点,对仪器设备要求低,一台水浴锅或恒温箱就能实现反应,结果的检测也很简单,不需要像PCR那样进行凝胶电泳,LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断,简便快捷,适合基层快速诊断。
[0017]从样本中提纯DNA、RNA(引物FIP/F3/BIP/B3;逆转录酶:链置换活性DNA聚合酶;Dntp;反应缓冲液一60°C左右(约35min左右)一目测或浊度仪
⑷试剂盒的组装:根据所建立的各种检测方法,组装成相应的试剂盒,并对试剂盒的特异性、敏感性、重复性进行检测,对试剂盒进行稳定性及保存期试验,建立生产质控标准,在重大疫病防控工作中发挥检测试剂盒的重要作用。
[0018]2、主要技术指标:
重大疫病确诊率达98%以上。核酸检出量:DNA(20pg;RNA(10pg。
[0019]创新点
1、在市场中鲜有报道,填补了国内市场空白。本项目中的猪瘟、猪蓝耳病二重RT-PCR快速检测试剂盒、猪伪狂犬病毒-猪细小病毒-猪圆环病毒2型多重PCR检测试剂盒和猪大肠杆菌毒力因子三重
PCR的检测试剂盒在市场中未见有报道,填补国内空白。
[0020]2、同时检测多种疾病,灵敏度高、特异性强。该试剂盒可同时扩增多种目的基因条带,同时检测两种或三种疾病,节省时间和试剂;灵敏度高,能将Pg量级的起始待测模板扩增到微克水平,在病毒的检测中,灵敏度可达3个RFU。
[0021]3、对临床标本要求低,应用领域广。对标本的纯度要求低,不需要分离病毒或细菌及培养细胞,可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。LAMP试剂盒可以应用的领域比较广泛,例如食品卫生监管、临床病原检测、转基因作物的检测、环境中病原微生物的检测等等。
[0022]4、可操作性强、结果容易判定、节省时间和费用、易于在基层推广应用。本项目中的禽流感H9、H5、猪圆环病LAMP法检测试剂盒具有简单、快速、准确、特异性强的优点。该试剂盒的检测设备只需要恒温水浴锅,目测即可得到初步结果,更容易在基层获得推广。扩增效率更高,整个扩增只需要Ih左右即可;结果容易分辨,可通过浑浊或荧光等现行定性判定结果;从扩增到结果检测可在一个封闭EP管中完成,避免接触引起的污染。
【权利要求】
、猪蓝耳病二重RT-PCR快速检测试剂盒、猪伪狂犬病毒-猪细小病毒-猪圆环病毒2型多重PCR检测试剂盒和猪大肠杆菌毒力因子三重PCR的检测试剂盒在市场中未见有报道,填补国内空白。
,同时检测两种或三种疾病,节省时间和试剂;灵敏度高,能将Pg量级的起始待测模板扩增到微克水平,在病毒的检测中,灵敏度可达3个RFU。