文档介绍：ELLMAN试剂测定自由巯基
试验基于的原理:
5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)
5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收,与巯基反应后,生成2-硝基-5-巯基苯甲酸(TNB)[1]。TNB2-在412nm有很强的吸收,可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
DTNB TNB2-
根据文献记载,*103M-cm-~*103M-cm-之间[3,4]。-。A=εbc,其中A为吸光度,ε是摩尔吸收光系数或消光系数,ε单位为升/(摩尔·厘米)[L/(mol·cm)]。(*103M-cm-),需要TNB的浓度为c=/(*103LM-cm-*1cm)=*10-5mol/L (*10-8mol/ml),*10-5mol/L*18790g/mol==.
我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有:
EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
在不同缓冲液中,TNB的最大吸收波长略微不同,所以它们在412nm的吸收也不
同,要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外,TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。
DTNB随着pH的升高,降解速度加快。,%/h,在
,%/h,随着pH值得升高,降解速度加快,在pH 12时,15min之内会完全降解[7,8]。
摩尔吸收光系数在不同的温度下不同,随温度的升高而下降[4].

试验方案
主要材料:

PEG-G-CSF 批号:080229
G-CSF 批号:080126
10k超滤膜 PALL

Sequencing Grade Modified Trypsin,Promega,lot#237826。20 ug/小瓶。加入20 ul 50mM NH4HCO3,,配成1 ug/ ul的酶液。
1M DTT 刘春凤提供
TFA(三氟乙酸):TEDIA Lot# 705114
乙腈:Fisher Scientific Lot# 055848
Starter kit for MALDI-TOF MS:BRUKER DALTONICS,Lot NO 2007-208241-001(including α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid(HCCA),peptide calibration standard,protein calibration standard I,protein calibration standard Ⅱ)
PEG肽段反相分离流动相
A液:%TFA/H2O
B液:%TFA/90%乙腈/H2O

质谱仪:BRUKER DALTONICS MALTI-TOF-TOF autoflexⅢ(厂内编号