文档介绍：蛋白质含量测定
——考马斯亮蓝法
实验十一
实验目的
掌握考马斯亮蓝法测定样品蛋白含量的原理和操作步骤;
进一步熟练分光光度计的原理和操作方法;
掌握标准曲线的制作和使用。
双缩脲(NH3CONHCONH3):凡具有两个酰***基或两个直接连接的肽键,都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。
Folin—酚试剂法(Lowry法) Folin—酚试剂中的磷钼酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物),在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。该法的灵敏度是双缩脲法的100倍.
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法:染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值,与蛋白质浓度成正比,灵敏度高比Lowry法约高四倍
实验原理
1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一.
考马斯亮蓝G-250染料,在游离状态下呈棕红色,在酸性溶液中当它与蛋白质结合后,变为蓝色,使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm。
在595nm测定的吸光度,与蛋白质浓度成正比。
Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
PROTEIN
+
Amax = 595nm
BLUE
Acid
Coomassie G-250
Protein - plex
O
CH
2
CH
3
NH
C
CH
3
CH
3
N
CH
2
SO
3
-
CH
3
CH
2
N
CH
2
CH
2
CH
3
SO
3
Na
+
Bradford 法的突出特点:
(1)灵敏度高。其最低检测蛋白质含量可达1mg,这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的吸光系数。
(2)测定快速,简洁,完成一个样品的测定,只要5分钟左右。染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟,其颜色在1小时内保持稳定(在5-20分钟之间,稳定性最好)
(3) 干扰物质少。
缺点:
(1) 各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此不同蛋白质时有较大的偏差;
(2)有一些去污剂等物质干扰此法的测定;
(3) 标准曲线也有轻微的非线形,因而不能用比尔定律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
此方法灵敏度比紫外吸收法高10-20倍。凯氏定氮法比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质.
器材与试剂
可见光分光光度计
试管
标准蛋白质溶液,用牛血清清蛋白(BSA)配置
考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg考马斯亮兰,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85% 的磷酸,用水稀释至1升。
(三)操作方法
(1)取6支试管编号,1支作空白,4支加标准蛋白溶液,1支留作未知样品。分别加入各种试剂:
试管编号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白溶液(mL)
0

待测样品(mL)
1
%Nacl (mL)
1

0
染液(mL)
4
4
4
4
4
4
蛋白质浓度(ug/mL)
0
20
40
60
80
?
(2)加完试剂混匀,2-5分钟后即可开始用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值,空白对照为1号管。
用标准蛋白质为横坐标,用吸光值A595为纵坐标,作图,即得一标准曲线。由此标准曲线,根据测出的未知样品吸收值,即可查出样品蛋白质含量。