文档介绍：农杆菌感受态细胞的制备[实验原理] 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中,首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。在基因工程操作中, 感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源 DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用 CaCl 2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的 CaCl 2 溶液中, 0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变, 此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70 ℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。[实验仪器、材料和试剂] 一、仪器: 超净工作台, 恒温摇床, 冷冻高速离心机, 高压灭菌锅, 冰箱, -70 ℃超低温冰柜,分光光度计,接种针, 10ml 试管, 50ml 离心管, 离心管,冰浴, 微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌,灭菌条件: 120 ℃, 15 分钟。二、材料:土壤农杆菌 LBA4404 菌株或其它农杆菌菌株三、试剂: YEB 液体培养基( 1L ): 酵母提取物 1g , 牛肉膏 5g , 蛋白胨 5g , 蔗糖 5g , MgSO 4· 7H 2O , ,高压灭菌。利福平( Rif )储液: 50mg/ml 20mM CaCl 2 ,高压灭菌。[实验步骤] 1 、挑取根癌农杆菌 LBA4404 单菌落于 3ml 的 YEB 液体培养基(含 Rif 50mg/l ) 中, 28 ℃振荡培养过夜; 2、取过夜培养菌液 1ml 接种于 50mlYEB ( Rif 50mg/l ) 液体培养基中, 28 ℃振荡培养至 OD 600 为 ; 3 、取 2ml 菌液, 13000rpm ,离心 30sec, 弃上清; 4 、加入 1000 μl 20mM CaCl 2 ,使农杆菌细胞充分悬浮,冰浴 30min ; 5、 13000rpm , 离心 30sec , 弃上清, 置于冰上, 加入 500 μl 预冷的 20mM CaCl 2, 充分悬浮细胞,冰浴中保存, 24hr 内使用,或液氮中速冻 1min ,置-70 ℃保存备用。质粒 DNA 直接导入农杆菌[实验原理] 在低温下,外源 DNA (质粒)可吸附到感受态细胞表面,诱导细胞吸收 DNA 。(加入热激原理)转化了质粒 DNA 的农杆菌随后 28 ℃恢复培养,可使质粒上携带的编码抗生素的抗性基因得到表达, 因此, 转化了质粒的农杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长,而没有转化的细胞则无法生长。[实验仪器、材料和试剂] 一、仪器: 超净工作台, 恒温摇床, 培养箱, 台式离心机, 水浴锅, 高压灭菌锅, -70 ℃超低温冰箱,培养皿,微量进样器及吸头。材料:根癌农杆菌 LBA4404 (或 EHA105 )感受态细胞,质粒 pCAMBAI1300+SPR 植物表达载体二、试剂:液氮 YEB 液体培养基( 1L ):酵母提取物 1g ,牛肉膏 5g ,蛋白胨 5g ,蔗糖 5g , MgSO 4 ? 7H 2O , ,高压灭菌。 YEB 固体培养基:每升 YEB 液体培养基加 15g 琼脂粉,高压灭菌。卡那霉素( Kan )储液: 50mg/ml 利福平( Rif )储液: 50mg/ml YEB