文档介绍：Western blot 原理
Western Blot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质混合物,经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物(NC膜,PVDF膜等)上后,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与其对应的抗体起免疫反应,再与酶标记的二抗体起反应,经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。
由于Western blot检测技术具有简便,快捷等特点,所以目前该技术也被广泛应用于蛋白质表达水平的检测。
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Western Blot 信号放大基本原理
经过SDS-PAGE分离的蛋白质、多肽等被转移到固相支持膜上,然后用蛋白质或多肽特异性的抗体来检测
一级信号放大
二级信号放大
一抗
抗原
抗原
一抗
二抗
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Western Blot一般流程
底片扫描、分析
底物显色
二抗孵育
一抗孵育
封闭
转膜
SDS-PAGE电泳
蛋白样品的制备
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Western Blot基本实验步骤
1、蛋白质提取:WIP或RIPA裂解细胞或研磨组织,离心,收集上清。
2、蛋白定量:先总蛋白定量,western后在依据内参定量。
3、电泳:依据需要检测蛋白的分子量选取胶的浓度,制胶,电泳。
4、转膜:半干或湿转,应用半干法转膜需防止短路。
5、封闭:5%脱脂奶粉或BSA封闭过夜或室温1小时。
6、一抗孵育:5%脱脂奶粉稀释一抗到合适的浓度,与膜室温孵育1小时或4度过夜,1x TBST洗膜3次,每次5分钟。
7、二抗孵育:5%脱脂奶粉稀释二抗到合适的浓度,与膜室温孵育1小时, 1x TBST,洗膜3次,每次5分钟。
8、显影(ECL法):将A、B发光液按比例稀释混合均匀滴在膜上。置于保鲜膜内固定于片盒中,迅速盖上胶片,关闭胶盒,根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min,清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影,清水冲净晾干。
9、图片分析:标定Marker,进行分析与扫描。
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贴壁细胞:细胞可以在培养皿里裂解,洗掉培养基,PBS洗2~3次,加入RIPA裂解液裂解,以可以将细胞消化下来,离心,PBS洗2~3次,加入RIPA冰上裂解液裂解30分钟(可提高蛋白浓度)。按6孔板100-200微升/孔的比例加入PIPA(可根据细胞多少调节裂解液体积), 4度,12000转,离心15分钟,收集上清.
悬浮细胞: 收集培养细胞,离心去除培养液,用PBS洗2-3遍,按6孔板加入100-200微升/孔的比例加入RIPA,用抢悬浮细胞。如果细胞数量较大,应按50-100万细胞/管分装或根据细胞数量按比例增加RIPA的用量,裂解完全时应无明显的细胞颗粒。4度,12000转,离心15分钟,收集上清.
组织样品:液氮研磨组织,按每20毫克组织加100-200微升的比例加入RIPA,冰上裂解30分钟,4度,12000转,离心30分钟,收集上清.
蛋白样品的制备
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蛋白样品的定量
Bradford法测定蛋白浓度
原理:此法基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下,可配成淡红色的溶液,当与蛋白质结合后,产生蓝色化合物,反应迅速而稳定。反应化合物在595nm处有最大光吸收值,化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。
考马斯亮兰溶液的配制:称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL95%乙醇,加入100mL85%(W/V)磷酸,将溶液用水稀释到1000mL,过滤。%考马斯亮蓝G250,%(W/V)乙醇,%(W/V)磷酸。
实验步骤:96孔板,对照20μl PBS,测定蛋白样品:18μl+2μl蛋白,加入200μl考马斯亮兰溶液,放置2分钟(在一个小时内测,时间变长,可能会产生沉淀),酶标仪上595nm处测定吸光值,这样只能相对定量蛋白,如果要定量蛋白,可以用不同梯度的BSA做标准曲线来定量蛋白
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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理:
SDS SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来, SDS 的平均结合量是 1: (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之 SDS后,由于 SDS 带强负价,使蛋白