文档介绍：聚合酶链式反应(PCR)扩增DN***段
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实验目的和要求
学****和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法,并深刻理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性。本实验以含有小鼠的基因(暂定T10)的质粒pCMV-Myc-T10为模板,扩增出约800bp的产物。
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1) 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR ):是一种对特定的DN***段在体外进行快速扩增的方法。
1985年 Kary Mullis及同事创立。随后借助于热稳定性Taq DNA聚合酶的发现(1976年Chien等分离的热稳定性Taq DNA聚合酶),使PCR自动化成为可能;1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置,使PCR技术进行实用阶段。1993年度,Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得诺贝尔化学奖。
2. 相关基础知识
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PCR 的特点及应用:
PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。因此,广泛应用于许多领域。
基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序等;
遗传病的产前诊断;
致病病原体的检测;
癌基因的检测和诊断;
DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证;
动、植物检疫;
在转基因动植物中检查植入基因的存在。
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原理类似于DNA的变性和复性过程,即在高温(93-95℃)下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;而后在低温(37~65℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链;在Taq酶的最适温度(72℃)下,以引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新链。这样,每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行,每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增,经过25~30个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上,实际上一般可达106~107倍。
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2)PCR 反应系统的组成
PCR反应系统的组成主要包括:
引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。
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引物:
要扩增模板DNA,首先要设计两条寡核苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段,两引物间距离决定扩增片段的长度,两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键, 因此,引物设计也就更为重要。
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PrimerI
PrimerII
Amplified target fragment
To 7
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引物的设计:
长度一般最低不少于16个核苷酸,而最高不超过30个核苷酸,最佳长度为20~24个核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列,如限制性酶切位点或增强因子等,以完成基因克隆和其它特殊需要,但要在酶切位点的5‘端加上额外的3-4个核苷酸,以确保附加的酶切位点有效。
两个引物之间不应发生互补,特别是在引物3’端,即使无法避免,其3’端互补碱基也不应大于2个碱基,否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”(Primer dimer)。
(G+C)%含量引物的组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中(G+C)%含量应尽量相似。
引物内部应避免内部形成明显的次级结构,尤其是发夹结构(hairpin structures)。
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~1μM之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异,但浓度过低,不足以完成30个循环的扩增反应,则会降低PCR的产率。
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