文档介绍：罗丹明B-Mn2+-H2O2体系同步荧光分光光度法
测定水果的抗氧化活性
1 前言
羟自由基(·OH)是活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基。它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用,造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤,使细胞坏死或突变。羟自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关。对机体适当补充外源性抗氧化剂或给予能促使机体内源性物质恢复到一定水平的药物,可改善这些状况。由于长期使用化学合成的抗氧化剂对入体有一定的副作用,所以,寻找天然、安全、无毒的抗氧化剂就越来越受到入们的重视。
对羟自由基的研究有许多,例如:荧光法研究高粱红色素清除羟自由基活性,为高粱红色素的合理开发和利用提供了一定的参考依据;罗丹明6G-Co2+-H2O2体系荧光法测定常见蔬菜的抗氧化活性,测定了14种常见的蔬菜的抗氧化活性,其中菠菜、油菜、韭菜、香菜、雪里蕻5种绿叶蔬菜的抗氧化活性较强;丁基罗丹明B-Fe2+-H2O2体系荧光法测定茶叶的抗氧化活性,对多种茶叶及枸杞的清除羟自由基作用进行了研究,充分利用了丰富的茶叶资源提高入体抗氧化性能。
目前,离体检测羟自由基的方法主要有电子自旋共振(ESR)法、化学发光法、光度法及荧光法,这些方法多是用传统的Fe2+-H2O2体系产生羟自由基,或Cu+、Co2+、代替Fe2+使灵敏度提高,对水果抗氧化活性的研究已有报道。本文采用同步荧光法和普通荧光法绘制荧光谱图,进行谱图比较,根据前入做过的试验预测采用同步荧光法比普通荧光法的灵敏度高,有效减少光谱干扰,用罗丹明B作指示剂,在Mn2+-H
2O2体系产生羟自由基(·OH),测定水果的抗氧化活性。从常见水果中寻找抗氧化剂,充分利用丰富的水果资源,具有实际意义。
2 测定原理
传统的Fenton反应是用Fe2+-H2O2体系产生羟自由基。本文研究发现,Mn2+亦可与H2O2作用,类似Fenton反应产生羟自由基,产率比FeSO4还要高,其反应原理可类推如下:
Mn2++H 2O2→Mn(Ⅲ)+·OH+ OH-
Mn(Ⅲ)十H2O2→Mn(IV)+·OH + OH-
然后,利用羟自由基迅速氧化罗丹明B,使罗丹明B的荧光强度显著降低,降低程度随羟自由基的增加而加大,从而间接测定羟自由基的产生量。而水果提取物可以部分清除溶液中的羟自由基,从而使其荧光碎灭程度减弱,据此可以测定水果抗氧化性。
3 实验部分
主要仪器与试剂
主要仪器
WGY-10型分子荧光分光光度计天津港东科技发展有限公司
SQ2119多功能食品加工机上海帅佳电子科技有限公司
TD4台式离心机湖南仪器表总厂离心机长
电子分析天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司
PHSJ-3F实验室pH计上海精密科学仪器有限公司
主要试剂
MnSO4·H2O(含量不少于99%) 天津市北方天医化学试剂厂
抗坏血酸(%) 天津市福晨化学试剂厂
H2O2(含量不少于30%) 天津市凯通化学试剂有限公司
罗丹明B 天津市津科精细化工研究所
***化铵(%) 天津市津东天正精细化学试剂厂
氨水(含量不少于25%-28%) 天津市赢达希贵化学试剂厂
所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水。
储备液的配制
干燥的小烧杯若干,1L容量瓶1只
100 mL容量瓶3只,1000 mL的容量瓶,塑料瓶,500mL容量瓶两只,50mL容量瓶5只,
10mL容量瓶20只。
2mL移液管4只,贴上标签(罗丹明B,Mn2+,H2O2,buffer。),100ml量桶(H2O2),10mL移液管3只(缓冲)
硫酸锰储备液的配制
准确称取MnSO4·,在小烧杯中用少量水溶解转移100 mL容量瓶中定容,配制成20 mmol/L溶液作为储备液。实验所用的浓度是2 mmol/L,移取10mL20 mmol/L储备液于100 mL的容量瓶中定容至刻度。
罗丹明B储备液的配制
准确称取罗丹明B g,在小烧杯中溶解,转移定容在1000 mL的容量瓶中,配成1×10-2 g/L的储备液。
1%双氧水储备液的配制
准确移取30% H2O23 mL于聚乙烯的塑料瓶中,再加87 mL的蒸馏水。
氨水储备液的配制
mL浓氨水,稀释至500 mL的容量瓶中,定容至刻度, mol/LNH3·H2O的储备液。
***化铵储备液的配制
g***化铵,在小烧杯中用少量水溶解,转移定容在500 mL的容量瓶中, mol/LNH4Cl的储备液。