文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
新型受缺氧调控的腺病毒载体的构建及应用
姓名:应磊
申请学位级别:博士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:钱关祥
20040501
新型受缺氧调控的腺病毒载体的构建及应用中文详细摘要正肿瘤的基因表达异常,如抑制原癌基因的表达、增强肿瘤抑制基因的表达等;恶性肿瘤是人类死亡的主要原因之一,手术、放疗和化疗等传统的治疗方法对肿瘤治疗的效果并不理想。近年来的研究表明恶性肿瘤的发生和发展与多个基因的表达异常有关,因此,恶性肿瘤从本质上讲是一种基因病。基因治疗可纠也可通过增强机体对肿瘤的免疫反应使肿瘤细胞无法免疫逃避,可从根本上抑制肿瘤的发生和发展。结合肿瘤基础研究的成果,近十年来的肿瘤基因治疗发展了多种治疗策略,但是并未取得预期的良好效果。原因之一是缺乏特异、安全而高效的载体系统。实体肿瘤中普遍存在缺氧,缺氧状态的肿瘤细胞代谢异常,外源基因的表达水平较低,同时存在对放疗和化疗的抵抗,是恶性肿瘤预后不良的主要原因。因此,将肿瘤的缺氧状态作为治疗的靶点已成为近年来基因治疗的热点。本研究通过构建腺病毒介导的受缺氧调控的人工转录因子的表达系统驱动选择性肿瘤抑制基因的表达,试图构建能特异地在乏氧的肿瘤细胞中表达的高效载体。~.人端粒酶逆转录酶启动子幕钚匝芯浚利用椒ù觩载体上分别扩增崩┰鋈笔个坏愕膆,与载体连接,构建荧光素酶报告载体。利用—椒ḿ觳、、、虷细胞中入端粒逆转录酶谋泶铮な嫡庑┫赴曛芯胁煌潭的泶铩@弥侍宸椒ńù胁煌ざ鹊膆的报告载体瞬时转染这些细胞株,经荧光素酶活性检测,报告载体显示不同程度的活性,膆在各种细胞株中的活性均较高,可用于基因治疗的进一步研究:坏闳コ蟾闷舳踊钚源蠓认陆怠6匀ǚ词轿姿诱导后的细胞的研究发现,击除坏愕膆活性进一步下调,推慕和上海第二区耕土学博士学位论文
④水平的表达,证实一捎行Ы榈寄康幕蛟谡婧讼赴械谋泶铩测在诱导分化过程中幕钚钥赡苡隨关系较为密切。〖肮δ苎芯浚利用—椒ù月龄人胚胎脾细胞扩增谋嗦胄蛄校序鉴定序列与文献报道一致后,╬一泶镌靥澹彩弊H虷细胞后抽提细胞总琑峁允颈泶镌靥蹇山榈糓在不同细胞系中有效表达;转染蟛舛ㄏ赴鲋澈突盍Γ琈一裳≡裥砸种浦琢鱿赴脑鲋常、和赴囊种坡史直鹞ァズィ嵌匀伺肾来源的赴の廾飨杂跋臁籑一靥遄H綡术赴螅秆周后计数单层细胞集落形成数,%左右。构建腗腺病毒载体,在病毒包装时未见明显的赴凋亡现象,可获得/的较高滴度。以—6哉赵靥澹圆同感染复数琈腥静煌赴辏軬表达效率和细胞状态,推测2煌赴腥続缶赏ü齊狿方法检测到表达;可检测到其蛋白质法测定细胞增殖,结果提示腺病毒介导的可有效地诱导肿瘤细胞的生长抑制,对,和纳ひ种谱饔贸ィ杂郎赴赴廾飨陨ひ种谱饔谩P翁Ъ觳饨峁崾荆珹感染可诱导肿瘤细胞发生凋亡的典型形态学改变,如细胞膜起泡、细胞核固缩、核碎裂等。蚉旧ń峁崾荆俨《靖腥后肿瘤细胞出现早期凋亡,笠酝砥诘蛲鑫V鳌实验证实,感染—后的细胞在裸鼠体内的致瘤性降低;肿瘤组织切片显示表达的本部分的实验结果表明一捎行Ы榈糓一谙赴械谋泶铮并可选择性地诱导肿瘤细胞凋亡。细胞的最适直鹞、和细胞形态向高分化肝癌转化。以和系和上海第二医科土学博士学位论文、、
⑨:本研究利用鞍字实奶匦裕潆牧粗械难跻览到到饨峁褂,和羧基端氧激活结构域,融合,构建含受缺氧调控的人工转录因子的表达载体;同时构建含岷衔坏愫蚑械娜斯て舳樱墒茏录因子激活而驱动下游基因的表达,构建以此驱动的荧光素酶报告基因载体,组成受缺氧调控的双质粒表达系统。以缺氧环境下培养的赴为模板,应用方法分别扩增牟煌峁褂颍庑蚣定成功构建一狾、一狢和籊—狢表达载体。一猳转染赴缶璆秆。竦梦榷ū泶锏南赴株,,后不能检出人工转录因子蛋白质。双质粒共转染和赴笠訡耗D馊毖酰馐愿孟低车谋泶锬芰褪苋毖跤盏嫉哪力,结果提示不同结构域均获得不同程度的诱导,但是表达水平较低。为优化这一融合蛋白,在虷Ⅱ转录激活结构域之间利用法引进一段编码龈拾彼岬男蛄校酝纪ü拾彼岜凼沽礁霾煌慕峁域分别获得更有利表现活性的空间结构。双质粒共转染不同细胞株后,在%夯肪诚屡嘌,荧光素酶活性检测结果提示含不同结构域的表达系统均有受缺氧激活的能力,其中狢在中获得倍以上的诱导,在谢竦兑陨系挠盏迹患尤敫拾彼岜酆蟾帽泶锵低车淖B蓟钚大为增强,在赴性銮苛薸兑陨希怯捎诨”泶镆灿兴加,受缺氧诱导的倍数下降。为进一步探究奶匦裕菇融合蛋白,瞬时转染结果显示稍谡Q趸肪诚陆榈糆降解,:可保护融合蛋白不被降解,提高其表达强度;:不增加作为对照的—融合蛋白的表达量。本研究成功构建了受缺氧调控的表达系统,并且证实山榈嫉鞍,与