文档介绍：纳豆激酶三维模型的构建,来源于纳豆杆菌的一种新型的纤溶酶纳豆激酶的一种新的亲核催化机理
原文来源:Journal of Molecular Graphics and Modelling 23 (2005) 373–380
译文正文:
摘要
通过同源建模,构建了一个由纳豆杆菌产生的纳豆激酶的三维结构模型。SB,SC,SE,SS四种连续蛋白的高分辨率X射线的结构和其功能上的同源性都被作为模板。研究人员构建了NK的原始模型,并利用Procheck方案进行了分析。通过约束分子动力学模拟,最优质的模型被选定来进一步完善。我们已经对成品模型的整体质量进行了评估,分析了成品模型NKC1,利用不同蛋白质的分析计划,包括Ramachandran图的质量评估的Procheck,检测其相互作用的PROSA,还有计算包装特性的WHATIF。研究发现,这种结构是被认可的,并且,经过一个长300PS不受约束的分子动力学模拟的证明,这种结构在室温下是稳定的。进一步的分析促进了纳豆激酶一种新的亲核催化机理,该机理是通过攻击催化环境和S221位点富含的羟基而诱发形成的。
关键词:纳豆激酶,纤溶蛋白酶,同源模型,亲核攻击,机理

纳豆激酶是由纳豆杆菌产生的一种具有纤溶活性的蛋白酶。与血纤维蛋白溶酶非常相似,NK能直接溶解纤维蛋白。此外,它还能提高体内血纤维蛋白溶酶和其它血块溶解剂的产生,包括尿激酶。在某些方面,NK实际上优于传统的血块溶解药物,其中有许多好处,包括口服方便,证实有疗效,效果持久,成本效益好,还能作为预防使用。研究已经证明NK的pH和温度的稳定性,以便于它能稳定的存在于胃肠道[1]。
NK是一个由275个氨基酸组成的单链结构,并且没有分子内的二硫键[2]。NK属于枯草杆菌蛋白酶家庭的丝氨酸蛋白酶,它具有同样保守的催化三联体(D32,H64,S221)和氧离子洞(N155)[3]。酶底物的结合位点(S125,L126,G127)也定位于枯草杆菌蛋白酶的S1和S4结合点[4]。NK与大部分的枯草杆菌蛋白酶保持高度的同源性,利用X射线晶体衍射和核磁共振技术,已经获得了很多枯草杆菌蛋白酶的三维结构,但是NK的三维结构仍是个未知数。
NK同源模型的产生利用的是SB,SC,SE和SS的三维结构,%,%,%,%。为了了解NK的催化机制和底物特异性,几种底物已经进入Lamarckian遗传算法模型结构的活性位点。通过计算酶—底物复合物的结合位点的氢键,我们已经确定NK与底物间的相互作用。根据我们的研究,我们试图解释这些结构间的相互关系和NK的功能。

NK的序列来源于NCBI蛋白质数据库(基因库登陆号为S51909)。来源于枯草芽孢杆菌家族的SB,SC,SE和SS的序列和结构是从RSCB蛋白质数据库获得的(蛋白库编号分别为为1AU9,1AF4,1SCJ和1GCI)。序列比对的推导利用了CLUSTAL W方案,并且应用了默认参数[5]。结构比对的获得和分析利用了GRASP数据包,也使用了默认参数[6]。并且,两种
比对结果都进行了检查和人工调整,尽量减少一些差异和插入数据。

NK和SB,SC,SE和SS之间的序列比对是用来推导NK的三维模型。基于多个模板的五种粗略的三维模型是利用MODELLER[7,8]。 [9]分析了这些模型的特性,利用GRASP数据包来比对它们的二级结构。[10]方案进行了预测。,选出了最好的模型(模型C),它的结构特性见表1。模型C具有更好的Ramachandran图和更广泛的二级结构图案,以便于被选来做进一步的精化。

Ramachandran图的特性表明了残基的数量(%),这些残基属于图的中心,允许,一般允许和不允许区域,有利因子显示了共价特性和总体的键的距离,对于一个可靠的模型来说这些数据应该大于-。
精化和分子模拟
模型C首次被精化是通过添加所有的氢原子,进行能量最小化到AMBER 7 [11]的SANDER单元,使用力场的PARM99。我们添加WATERBOX216单元来形成八面体系统,采用8A界限进行非结合的相互作用。该最小化方案包括最速下降的2500个步骤,紧接着还有共轭梯度的2500个步骤。100 kJ/mol/A2的谐波限制适用于所有的蛋白质原子[12]。最小化后,我们获得了最终的精化模型C1。我们还利用PROCHECK检查了该模型的特性。