文档介绍：DNA的提取方法
中德美联致臻溯源
DNA提取方法:
有机(饱和苯酚-***仿)提取法
Chelex-100树脂提取法
磁珠提取法
一、饱和苯酚-***仿抽提法
饱和苯酚-***仿抽提法提取DNA在研究DNA基因座的多态性中,特别是在提取完整的基因组DNA中应用广泛。
饱和苯酚-***仿提取原理及步骤
提取原理:
1、用酚抽提细胞DNA时,有什么作用?使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。使用酚的优点:;。
缺点:-15%的水,从而溶解一部分poly(A)RNA。。
2、***仿的作用?***仿:克服酚的缺点;加速有机相与液相分层。最后用***仿抽提:去除核酸溶液中的迹量酚。(酚易溶于***仿中)
3、用酚-***仿抽提细胞基因组DNA时,通常要在酚-***仿中加少许异戊醇,为什么?异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生。另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
4、用乙醇沉淀DNA时,为什么加入单价的阳离子?用乙醇沉淀DNA时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,如NaCl 或 NaAc,Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,而易于聚集沉淀。
饱和苯酚-***仿提取步骤
【实验原理】
DNA 易溶于水,不溶于有机溶剂,而蛋白质在有机溶剂存在时变性沉淀。利用核酸和蛋白质对酚和***仿变性作用的反应性不同分离核酸与蛋白质后,在高盐存在下用乙醇沉淀收集DNA。
【实验试剂】
%枸橼酸钠抗凝剂 %盐水
缓冲液 %SDS
(20mg/ml)
7.***仿 %及100%乙醇
9. 3mol/L 醋酸钠
缓冲液
【实验方法】

(1)血液样品
①将抗凝血以2000~3000rpm 离心10min; Eppendorf管中,%盐水1ml,混匀,使红细胞溶解,10000rpm 离心10min,弃去上层血红蛋白溶液,白细胞沉淀于管底。重复此步骤至血红蛋白溶液层为透明,弃上清。
②沉淀的白细胞中加入1mlSTE,混匀,10000rpm 离心10min,吸去上层STE 。
注意事项:根据血液量调整消化提取体积。
(2)血痕样品
①取适量血斑连同载体剪碎,置于试管中。
②加适量无菌水(以检材全部浸湿,检材表面还保留有1~2mm 左右高度的溶液层为宜)浸泡10min。10000rpm 离心10min,弃上清。
③加入适量STE 液悬浮沉淀物()。注意事项:若检材陈旧可适当延长浸泡时间。含杂质很多的检材,可用酚、***仿进一步提取,用G-50 过柱,或用microcon 纯化试剂处理。
(3)软组织样品
①先将组织用灭菌去离子水、乙醇冲洗灭菌。
②取10~20g 组织剪碎,加入2ml STE,用匀浆器研磨制成单个细胞匀浆。
注意事项:为减轻机械剪切力对DNA 的损伤,应尽量温和操作,缩短均浆时间。

处理后的样品中加入1/10 体积的10%SDS 和1/20 体积的20mg/ml 的蛋白酶K,使终浓度分别为1%和100μg/ml,置于55℃温水浴中3~4h。
注意事项:消化的温度也可以是37℃过夜。
抽提
消化完全后,用等体积的酚、酚/***仿、***仿各抽提DNA 一次:
(1)加入等体积的饱和酚,温和地上下颠倒混合,将管内溶液混合成乳状液。10000rpm离心10min。
(2)转移上层水溶液到另一Eppendorf 管,加入1/2 体积的酚和1/2 体积的***仿,混匀,10000rpm 离心10min。
(3)转移上层水溶液到另一Eppendorf 管,加入等体积的***仿,混匀,10000rpm 离心10min。
注意事项:酚抽提时如果上清液太粘,不能和蛋白质分开,可以加适量TNE 稀释,然后再用酚提取;酚具有腐蚀性,***仿具有神经毒性,操作时必须注意。