文档介绍：摘要
本文就质粒DNA在羧基纳米磁性粒子表面的可逆化吸附行为做了相应的试验研究和理论探讨。分别考察了不同PEG浓度梯度对SPRI法和PEG静置沉降法提取质粒DNA的影响。通过比较发现,质粒DNA在纳米磁性粒子表面的吸附受PEG浓度的影响很大;当PEG浓度高于9%时,质粒DNA在粒子表面大量吸附,而对于PEG静置沉降法,此临界浓度为11%,说明质粒DNA在羧基粒子表面的可逆化吸附行为与DNA脱水有关,并受表面羧基的影响。羧基与带负电荷的DNA之间可能通过Na+形成静电桥而相互吸引,使得质粒DNA在羧基纳米磁性粒子表面大量吸附。
关键词: SPRI, PEG, 质粒DNA, 固相载体, 静置沉降法
目录
摘要 1
关键词 1
前言 4
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PEG浓度对静置沉降法提取质粒DNA回收的影响 7
PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA回收的影响 7
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PEG浓度对静置沉降法提取质粒DNA回收的影响 10
PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA的影响 11
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PEG浓度对静置沉降法提取质粒DNA回收的影响及机理 13
PEG浓度对SPRI法提取质粒DNA的影响及机理 14
参考文献 17
致谢 19
前言
细胞及各种生命大分子如核酸、蛋白质和多肽等的分离纯化是生命科学各研究领域必不可少的环节。分离纯化技术的高低对整个生物科学的发展有着举足轻重的作用。细胞裂解后经离心所得到的质粒DNA粗提液,一般来说,不能直接供分析使用,而需要经过一定的纯化步骤,以得到相对较纯的质粒DNA。传统的DNA纯化方法多基于层析和离心沉降,特别是当今众多的商业化DNA提取试剂盒,将该特点发挥到了极至。但传统的方法需要层析柱、有毒试剂(如苯酚)和昂贵的离心机,费力、费时,投入大而且不利于简化操作。利用磁性载体分离纯化质粒DNA近几年来得到各国科研人员的重视。与传统方法相比,磁性载体法具有很大优势:首先,对离心机依赖程度大大降低,甚至可以免去离心;其次,操作简单,有时可集所有操作于一只离心管中完成,中间只涉及到几种试剂的添加;第三,可实现微量分析要求,且得到的质粒DNA可不经洗脱而直接用于PCR[1]。此外,磁分离法操作缓和,有利于保证DNA完整性。
由于磁性载体的表面性质不同,其分离纯化原理也不一样。其中基于固相载体可逆化固定[2](solid phase reversible immobilization,SPRI)的分离纯化方法得到了广泛的研究和应用[3]-[5](如dynal和agencourt公司的DNA磁性粒子,HGP测序任务的三分之一都是借助agencourt的产品完成的)。在一定浓度的PEG和盐离子环境中,DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁性微球的表面,该吸附过程是可逆的,在适当的条件下,结合的DNA分子可以被洗脱回收。[6]-[8]
然而,羧基高分子表面结合DNA的原理至今还不甚清楚,关于这方面研究也鲜见文献报道。本研究通过设置一系列的PEG浓度梯度,以研究质粒DNA在羧基化纳米磁性粒子表面的吸附状况。吸附多少以质粒DNA的产量来表示。作为对照,在不添加该磁性粒子的条件下,研究了不同PEG浓度梯度下静置沉降法
[9][10]对质粒DNA提取量的影响。并对静置沉降法和SPRI法中PEG的浓度变化对质粒DNA回收的影响做了比较和理论探讨。

大肠杆菌JM109(携带pET15b质粒,大小5407bp),LB液体培养基(1%蛋白胨,%酵母提取物,1%NaCl,,高温灭菌后补加氨卞青霉素到50ug/ml);LB固体培养基(1%蛋白胨,%酵母抽提物,2%琼脂,1%NaCl,,高温灭菌后补加氨卞青霉素到50ug/ml,制成斜面),Solution A():50mM Tris-HCl(),10mM EDTA (), 400ug/ml RNase,4℃保存,Solution B;200mM NaCl,1%SDS;