文档介绍：DNA重组质粒的构建
基因克隆 gene cloning
应用酶学的方法,在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子(重组体),继而通过转化或转染宿主细菌或细胞、筛选出含有目的基因的转化子细菌或细胞,再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝。
核心技术:DNA重组技术
( binant DNA technique )
基因克隆的基本程序: 分—切—接—转—筛
PCR 酶切连接转化&转染抗性或标记筛选
目的基因DNA片段的获得
外源DNA分子与载体DNA分子的体外重组
重组DNA分子转移到适当的受体菌或细胞
重组DNA 分子克隆的筛选和鉴定
目的基因或其表达产物的纯化和鉴定
基因克隆技术的特点: 1. 可在体外人工的, 有目的的, 根据需要进行基因的重组、表达、测序、诱变、修复; 2. 方法简便、快速、准确、特异,能保证研究与开发的需要。
基因克隆示意图
胰岛素
人生长激素
干扰素
白细胞介素2
粒细胞集落刺激因子
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
红细胞生成素 EPO
组织纤溶酶原激活剂
生长激素
促生长素
抗血友病因子Ⅷ
脱氧核糖核酸酶
葡糖脑苷脂酶
鼠单克隆抗体
例:
干扰素是治疗癌症的重要物质,,因而其价格昂贵。但美国有一家公司用遗传工程方法合成了价格低廉、药性一样的干扰素,其具体做法是:
从人的淋巴细胞中提取能指导干扰素合成的基因,并使之与一种叫做质粒的DNA结合,然后移植到酵母菌内,从而用酵母菌来产生干扰素。
酵母菌能用出芽方式繁殖,速度很快,所以,能在较短的时间内大量生产干扰素。利用这种方法不仅产量高,并且成本也较低。
DNA重组操作过程
载体
外源DNA片段
外源DNA插入
剪切
引入宿主细胞
a
b
b
A
重组
A
b
抗性筛选
重组筛选
重组质粒构建:目的DNA的PCR扩增
DNA片段和载体的酶切
片段DNA与载体的连接
载体: plasmid(primary)
工具酶:限制性内切酶
连接酶
常见的基因工程载体
载体:用于携带重组DNA,并且能够使外源DNA一起复制与表达的运载工具。
根据来源:plasmid; phage; viral; BAC; YAC
根据用途分:克隆载体;原核生物表达载体;真核生物表达载体
根据与宿主的关系分:整合性载体、非整合性载体
基因工程中用得最多的是plasmid载体。下面介绍几种常见的载体。
载体的基本结构单元:

其他条件:

:包括宿主、转化(或转染)、分离纯化、重组等等。