文档介绍：实验三、目的基因的PCR扩增1、掌握PCR反应的基本原理与实验操作技术2、学****PCR扩增仪的使用一、实验目的聚合酶链式反应(PCR)是一种体外DNA扩增技术,具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等特点。PCR工作原理类似于DNA的体内复制过程,是将待扩增的DN***段和与其两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸,将该寡核苷酸作为引物,引物序列将决定扩增序列片段的特异性和片段长度。二、实验原理PCR(聚合酶链式反应)包括3个基本步骤:⑴模板变性(92℃-96℃):目的双链DN***段在94℃下解链;⑵退火(37℃-65℃):寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对,形成局部双链;⑶延伸(72℃):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板,dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。由这3个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25—35轮循环就可使DNA扩增达106倍。Melting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x5’3’3’5’3’5’5’5’3’5’3’5’5’5’5’5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’5’ddH2O10×PCRbuffer(withMgCl2+)dNTPTaq酶模板DNA引物DNAMarker琼脂糖6×DNA上样缓冲液三、实验试剂(一)PCR反应所用溶液融化后置于冰上。依次混匀下列试剂:四、操作步骤(1)×PCRbuffer(withMgCl2)(2)混匀(手指轻弹Eppendorf管底部离心2-5s)(3)加石蜡油少许封住溶液表面(4)PCR扩增