文档介绍：分子生物学实验
实验十一目的基因的PCR扩增与检测
第2周
分子生物学实验仪器设备简介和实验有关内容介绍
第3周
从植物组织提取DNA
第4周
从动物组织提取DNA
第5周
原核细胞质粒DNA的提取
第6周
核酸的琼脂糖凝胶电泳
第7周
紫外分光光度法测定核酸含量和纯度鉴定
第8周
限制性内切酶酶切质粒DNA
第9周
凝胶电泳回收和纯化DN***段
第10周
细菌感受态的制备
第11周
质粒DNA的转化
第12周
目的基因的PCR扩增与检测
第13周
原核蛋白质SDS-PAGE电泳
第14周
考试
一、实验目的:
熟悉PCR方法体外扩增DNA的基本原理,掌握PCR技术的常规操作,了解PCR引物及参数的设计。利用PCR扩增的方法获取用于表达的目的基因(CYP6B6)。
二、实验原理:
PCR扩增是一种类似于DNA的天然复制过程,以待增的DNA为模板、在体外由引物介导的酶促合成特异性DN***段的方法。
PCR方法体外扩增DNA的基本原理图示
预变性(双链DNA解链)
94C, 5min
变性(94C ,30s-1min)
复性(引物与单链DNA结合)
55C,30s-1min
延伸(72C,1-3min)
总延伸(72C,5-10min)
(25-35cycles)
PCR的一般过程:
经过30次的循环, 扩增的DN***段可达100万倍以上。
(1)引物长度应为15~30个核苷酸,Tm可按下列简单公式计算:
Tm=(G+C)x 4 +(A+T)+35- 2n
(2)引物中碱基的分布应当是随机的,避免出现一连串的单一碱基或产生二级结构。
(3) G+C碱基的含量在45%~55 %左右。
(4)两个引物在3 端均必须与模板互补,5端可以不互补。
(5)引物自身连续互补碱基小于4个。
(6)引物之间连续互补碱基亦应小于4。
引物设计的一般原则
设计和选择高效而且特异性好的引物是PCR的关键
循环参数:
①变性(denaturation)
变性是高温短时, 94C ,30s-1min。同时在第一轮循环前先进行94℃预变性5min,以便使模板DNA完全解链。
②退火(annealing)
实际使用的退火温度要比引物的Tm低5℃。退火温度在55~72℃之间都会得到好的结果。
③延伸(extension)
一般引物延伸是在72 ℃下进行。对2Kb长的产品扩增时间多采用1min。
④循环次数(cycle)
一般为30个循环,如果循环次数过多会增加非特异性产物的量。
1、
55℃*
30s
90s**
7min
45s
1. eppendorf管,添加以下各种成分反应液
ddH2O µl
模板DNA µl(20-40ng)原质粒进行1:20倍稀释
上游引物(100µmol/L) µl
下游引物(100µmol/L) µl
dNTP mixture(10mmol/L) 2 µl
10倍×缓冲液 µl
Taq酶 µl
总体积 20 µl
2. 稍作离心,将反应管放入PCR仪中。
2、反应体系: (CYP6B6)