文档介绍：BrdU标记在大鼠睾丸支持细胞体外培养中的应用
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【摘要】目的: 探讨大鼠睾丸支持细胞原代培养5溴2脱氧尿苷(BrdU)的最佳标记时间、剂量。方法: 大鼠睾丸支持细胞进行体外原代培养; 以终浓度分别为5、 10、 15、 20 μmol/L的BrdU检测睾丸支持细胞的最佳标记剂量; 在细胞培养的12、 24、 36、 48 h掺入BrdU, 使终浓度为15 μmol/L, 测定BrdU的最佳标记时间; 免疫细胞化学法跟踪观察大鼠睾丸支持细胞在体外培养中的分化
发育情况和BrdU标记率。结果: 免疫组化检查提示最终浓度为15 μmol/L和孵育36 h BrdU标记率均90%, 并且连续传3代均可检测到。结论: 终浓度15 μmol/L及孵育36 h为BrdU标记睾丸支持细胞的最佳剂量及时间, 表明BrdU 标记可用于睾丸支持细胞体内后的存活、生长的动态观
察。
【关键词】睾丸支持细胞体外培养 BrdU
5溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记法作为一种简便、敏感、特异的检测方法, 在医学的各个领域都有广泛的应用。BrdU掺入合成的强度可直接显示细胞增殖的能力, 同时能避免以往应用3H
TdR检测对细胞的放射性损害[1]。睾丸支持细胞缺乏有效的标记方法, 因此本实验的目的是应用BrdU体外标记原代大鼠睾丸支持细胞(sertoli cell), 观察最佳标记时间及标记量, 从而为追踪BrdU标记的睾丸支持细胞移植入体内后的存活、生长及分化的动态变化过程打下基础。
1 材料和方法
材料
SD雄性大鼠(体质量约100 g, 17~22 日龄)购于第四军医大学动物试验中心; DMEMF12培养基、优质胎牛血清购自Gibco公司, 胶原酶、胰酶、 BrdU购自Sigma公司; 抗 BrdU抗体及SABC试剂盒均购自武汉博士德公司。
方法
大鼠睾丸支持细胞体外分离培养
取大鼠睾丸, 剥除被膜, 收集睾丸实质于50 mL离心管中, 4℃ 900 r/min离心4 min, 倾去上清。按每克睾丸组织加8 mL g/L胰蛋白酶, 32℃ 210 r/min振荡、消化30 min。加入培养液终止消化, 待组织沉降后, 弃去上清。重复此步骤3次。再以每克睾丸组织加6 mL1 g/L Ⅰ型胶原酶, 34℃ 210 r/min振荡, 消化30 min。用100目钢筛过虑收集细胞, 900 r/min离心10 min, 收
集细胞, 用含100 mL/L胎牛血清的培养液洗3次(900 r/min, 3 min),
×109/L, 接种于25 cm2塑料培养瓶。34℃、 CO2培养箱中50 mL/LCO2培养48 h, 于倒置显微镜下观察细胞贴壁情况(图1), 吸去培养液后加入20 mmol/L, HCl缓冲液低渗处理3 min后, 用培养液洗涤2次, 洗去大部分生精细胞。加入含100 mL/L胎牛血清的DMEMF12培养液继续培养, 逐日更换培养液并进行观察。
传代后大鼠睾丸支持细胞的鉴定
g/L胰酶消化并洗