文档介绍：siRNA抑制ADAR1的表达对混合培养的小鼠淋巴细胞周期和凋亡的影响
作者:霍斌亮蔡磊马俊张福琴赵青川
【摘要】目的:探讨RNA编辑酶ADAR1的表达受抑制后,小鼠淋巴细胞的细胞周期和细胞凋亡的变化. 方法: 用电转法将ADAR1特异性siRNA转入到处于混合培养的小鼠淋巴细胞中,培养48 h,RTPCR检测转染效率;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化;RTPCR检验周期蛋白D1(cyclin D1)基因和周期蛋白A1(cyclin A1)基因表达量的变化. 结果: 转染ADAR1特异性siRNA 48 h后,小鼠淋巴细胞G0/G1期细胞量增加,S期细胞量减少,G2/M细胞量保持恒定. 另外,cyclin D1基因的表达量降低而cyclin A1基因表达保持恒定. 结论: 处于经典混合培养体系下的小鼠淋巴细胞,在其RNA编辑酶ADAR1受到特异siRNA抑制后,小鼠淋巴细胞的周期受到明显抑制,细胞凋亡增加.
【关键词】小干扰RNA;ADAR1;淋巴细胞;细胞周期;细胞凋亡;小鼠
0引言
ADAR1(RNAdependent adenosine deaminase 1)是近来研究最为重要的一种RNA编辑酶,目前发现它与众多疾病的发生进展有关[1-3]. ADAR1是通过脱氨基的方式使RNA特异位点腺嘌呤核苷变为次黄嘌呤核苷,从而改变RNA的遗传密码,进而使其编码的蛋白质结构和功能也发生改变. RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double
stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象. Small interfering RNA(siRNA)是一种小RNA分子(21~25核苷酸),能介导识别并靶向切割同源性mRNA,高效抑制靶mRNA的表达. 我们应用RNAi技术借助混合淋巴细胞培养试验模型研究ADAR1特异的siRNA对小鼠淋巴细胞周期和凋亡的影响, 进一步揭示ADAR1在移植排斥中的作用.
1材料和方法
和 C57小鼠,雄性,18~25 g,各5只(第四军医大学实验动物中心),淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司),DMEM培养基(美国GIBCO公司),标准胎牛血清(天津市颢阳生物制品科技责任有限公司), ADAR1特异的siRNA片段及阴性对照siRNA(广州锐博生物科技有限公司),反转录试剂盒(Fermentas公司),2×Taq PCR MasterMix(北京天为时代科技有限公司),4308电转电融合仪(Eppendorf公司),Mastercylerep型PCR扩增仪(Eppendorf公司),EPS 2A200型电泳仪(Amersham Biosciences公司),FR200凝胶成像系统(上海复日科技有限公司),1100 pro型分光光度仪(Ultrospec公司),318K型离心机(Sigma公司),流式细胞仪(BD公司).

,ADAR1基因上游引物5′CCTGTCAGCGGGTTGTTAGAGTA3′,下游引物5
′ATAGATTCATCAAGT3′