文档介绍：农杆菌介导iaaM 基因黄瓜遗传转化体系的建立
苏绍坤, 刘宏宇, 秦智伟*
(( 东北农业大学园艺学院,黑龙江哈尔滨150030)
收稿日期:2004- 03- 21
基金项目:国家高科技研究发展计划( 863) 资助项目( 2002AA2
7013)
作者简介:苏绍坤( 1978- ) , 男, 黑龙江人, 硕士研究生, 研
究方向为蔬菜分子遗传育种。
* 通讯作者E- mail: ******@126. com
摘要:以已经建立的高频黄瓜再生体系为基础, 从影响黄瓜转基因体系的农杆菌侵染时间, 共培养时是否
加入乙酰丁香酮等因素优化了黄瓜遗传转化体系; 将单性结实基因iaaM以农杆菌介导法导入到东农649 品种黄
瓜子叶节中, 经过不定芽诱导和生根等过程获得了转基因株系, 通过特异性引物的PCR 鉴定, 40 个株系扩增出
iaaM目的基因片段。PCR- Southern 检测为阳性。转基因阳性植株移栽到温室中, 其果实经检测80%为单性结实
黄瓜。
关键词:黄瓜; 单性结实基因iaaM; 遗传转化; 抗性鉴定
转基因技术在黄瓜上的应用一直受再生频率
和遗传转化频率低的限制, 国内外从事黄瓜体外
再生研究主要是从原生质体培养和体细胞悬浮培
养入手[1- 2], 这些方法同样难以提高遗传转化频率。
因此, 建立一个高效的再生及遗传转化体系对黄
瓜转基因研究具有十分重要的意义。黄瓜在我国
栽培广泛, 在蔬菜生产和国民经济中均占有一定
的地位。我国保护地栽培的面积正不断扩大, 目
前, 黄瓜的栽培面积仅次于番茄居第二位, 所用
的品种多为长春密刺、津春系列和津优系列等,
这些品种在其开花坐果期往往受到低温的影响或
遇到多阴连雨的天气将导致授粉受精不良、结果
率低、果实易表现畸形而导致减产和降低果实的
商品性。若进行人工授粉或饲放蜜蜂授粉, 则增
加生产成本, 降低效益, 而单性结实品种可以克
服以上缺陷。本实验将单性结实基因iaaM导入黄
瓜中, 增加子房中生长素的含量, 提高转基因植
株的单性结实率, 不仅为黄瓜的育种提供了单性
结实能力的新材料, 而且还为分子水平上的黄瓜
果实发育研究打下基础, 为甜瓜, 西瓜等其它园艺作物的单性结实研究提供参考。
1 材料与方法
植物材料及无菌苗培养
黄瓜亲本品种649 由东北农业大学园艺学院瓜
类课题组提供; 黄瓜种子在50%次氯酸钠中消毒
10 min, 在70%酒精中消毒30 s, 无菌水冲洗5~6
次, 然后接种于琼脂固体培养基。在组织培养室中
培养得无菌苗。
根癌农杆菌及其质粒
采用根癌农杆菌LBA4404 菌株, 其中含质粒
pCAM- 2A12iaaT, 该质粒带有单性结实基因iaaM
和抗卡那霉素( Km) 筛选的新霉素磷酸转移酶NptⅡ
基因, 基因表达由启动子2A12 调控。
菌株的培养
将农杆菌划线培养在含有50 mg·L- 1 卡那霉素
和50 mg·L- 1 链霉素, 50 mg·L- 1 利福平的YEB 培养
基上, 长出菌落后, 挑取单菌落接种于10 mL YEB
液体培养基中, 28 ℃振荡培养, 过夜。取5 mL 接
种于50 mL YEB 液体培养基