文档介绍：农杆菌介导人源轮状病毒抗原蛋白虶基因遗传转化花生的研究中文摘要花生是世界范围内的一种重要的油料经济作物,含有丰富的蛋白质和其他营养物质,其蛋白质含量可达%。同时花生贮藏期长,生产规模不受限制,因此花生是生产口服基因工程疫苗的理想载体。本研究所用农杆菌菌株为。质粒为双价表达载体,含启动子连接的人源轮状病毒抗原蛋白丢托旅顾亓姿嶙R酶颍匆钥敲顾抗性基因作为抗性筛选基因。研究选用了花育号和鲁花号龌ㄉ耘嗥分郑宰右段M庵蔡褰⒑屯晟屏俗右对偕体系,研究发现在难坑盏寂嘌铮ㄓ号和鲁花号子叶外植体丛生芽诱导率均最高,分别达.%和.%,予叶再生体系是目前比较理想的花生转化体系。研究影响子叶再生体系转化效率的因素表明,当菌液枷为、侵染时间⒐才嘌奔⒚菌液添加烟草提取物可获得较好的转化效果。对抗生素浓度对芽分化率的影响研究发现,当头孢霉素/Ⅳ溶星嗝顾疞时,效果最好,不但可以完全抑制农杆菌生长,而且有较高的芽诱导率。本研究对抗闹仓杲辛薖检测、杂交,分子生物学技术检测,证实了人源轮状病毒抗原蛋白虶基因已经整合到了花生栽培品种鲁花号和花育号的基因组校选取株表现剐缘幕ㄉ仓杲衈蚧虻腜检测,经デ脂糖凝胶电泳分析,结果有株能扩增出笥业腘基因条带,阳性率约为.%,提取蛳允疚Q粜缘闹仓暌镀珼作模板,用基因特异引物进行┰觯蠳基因阳性的植株均扩增出了约的特异性条带,而野生型没有,初步证明蛞颜系交ㄉ蜃橹小对部分转基因植株进一步进行咏缓蚐咏环治觯果发现部分转基因植株中出现了阳性杂交信号,这表明虻娜芬丫到花生的基因组中,并且是单拷贝。用分析了株转虻闹山东师范大学硕士学位论文疞,
株,结果表明插入鲁花号中的蛞丫WB肌以花生为生物反应器开展口服疫苗研制是完全可行的,本研究利用花生基因工程表达系统生产轮状病毒口服疫苗的前期产物重组抗原蛋白,为将来进一步研制抗病毒口服疫苗奠定基础,具有较高的实践价值和研究价值。研制成功,不仅使婴幼儿免受由人源轮状病毒琀鸬母剐何:Γ档突者的死亡率和治病费用,还可以为我国在利用植物生物反应器生产人体疫苗方面积累宝贵的经验。关键词:花生,颍诜呙纾└司榈分类号:山东师范大学硕士学位论文
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第一部分文献综述参镆呙绲难芯拷随着生物科学技术的高速发展和植物细胞培养及再生方法的日益完善,人们不仅在改造植物本身的遗传性状及创造新品种方面取得了令人瞩目的成就,而且在把植物作为新型的天然生物反应器生产疫苗、药物和抗体等有重要经济价值的外源蛋白方面也取得了可喜的进展。从八十年代中期开始,植物疫苗技术以美国为中心进行研究:现在,植物疫苗正作为分子农业的一部分进行着研究开发。植物疫苗可以应用于人、家畜、野生动物,与以往的疫苗相比,其最大魅力在于低廉的价格。如今,几乎所有的疫苗都是灭活疫苗或减毒疫苗,而成分呙缡墙ɡ吹姆⒄骨魇啤3煞忠苗的代表是乙型肝炎疫苗,它仅由防止病原体感染的重要成分组成。但植物疫苗的普及应用还需要很多的基础研究。从世界范围内的一些研究报告可见,植物疫苗食物即可获得免疫的“可食疫菌”,无论从消费方面还是接种途径方面都是极具魅力的。这种通过食用重组作物的方法诱导肠管免疫组织的免疫,替代了以往注射投予疫苗抗原的办法。现在,正在研究怎样才能诱导机体对经口摄取的蛋白质产生高效强烈的免疫反应。植物疫苗的起初研究主要是以烟草、马铃薯等为对象,年次报道了在烟草中表达链球菌乖癝琓年谝淮瘟俅彩匝橹っ髁俗V参镆呙缭诘挚勾拘约膊》矫娴木薮笄蹦堋4邮用角度出发,已经开始在水稻、花生、玉米、大豆等植物种子的可食部位进行研究。在这些植物种子的胚乳部分期待疫苗基因能得到高度表达和稳定的蓄积。利用植物作为抗原表达和递送的载体已经成为当今生物技术研究的热点之一。迄今为止,植物疫苗的研究成果几乎都是以人及动物感染性疾病为对象的,但对自身免疫疾病及过敏症的预防也有利用重组植物的可能。如针对杉树花粉症,将杉树花粉的过敏原重组于胡萝卜等的研究正在开展之中,这是利用经口免疫耐受以抑制过敏反应的一种尝试。另外,有人计划利用植物制成感染性疾病诊断用抗原系列。通过基因工程技术烟草中可以表达产生乙型肝炎病毒的核心蛋白质,烟草叶就可用来去完成数万人的诊断,这项研究如果成功,将具有划时代的