文档介绍：中山大学
硕士学位论文
杂合肽Moricin-Cecropin的分子设计、克隆与表达
姓名:李丽
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:庞义
20070608
杂合肽的分子设计、克隆与表达摘要专业:生物化学与分子生物学硕士生:李丽导师:庞义教授抗菌肽由于其特殊的作用机理和功效,,某些抗菌肽的抗菌活性还不够理想,这就需要结合抗菌肽活性与结构的关系有目的地对其进行改造和设计。本文应用抗菌肽分子设计的一些理论与方法将本实验室保有的珻昆虫抗菌肽基因进行了人工设计与改造,合成了新的瓹雍想幕序列,以期获得抗菌谱更广,活性更强的重组抗菌肽分子。为了获得小分子杂合肽的高效可溶性表达,本实验将杂合肽基因与泛素基因序列融合分别克隆到大肠杆菌表达载体琾蚿薪兄刈榭咕幕虻娜诤媳泶镅芯俊N了不影响成熟肽的结构与功能分析,杂合肽基因序列的合成及其与泛素基因的融合都是通过重叠延伸ê铣傻摹M倍苑核佤然怂饷竃晒寺⒈达与纯化,解决了泛素融合蛋白的酶切问题,为以后泛素融合表达外源基因的去泛素化提供了很好的工具酶。关键词:抗菌肽,,雍想模核兀琘诤媳泶中山大学硕士学位论文
,,,:&琍,:..甌,七.‘Ⅱ
刖昂抗菌肽且焕嗝庖咝вσ蜃樱巧锵赴囟ɑ虮码产生的一类小分子多肽,由霭被岵谢槌桑渖珊褪头攀腔逖字反应的组成部分,是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障。抗菌肽具有分子量小、热稳定、水溶性较高,广谱抗菌的特点远ê斓龋并能选择性地杀伤癌细胞,而对正常的真核细胞不起作用。改造过的抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性和阴性细胞,也作用于真菌、原虫、某些病毒和肿瘤细胞。同时,还能加速免疫和伤口愈合的过程。在目前抗生素的发现极其困难的情况下,抗菌肽为开发新的抗菌肽、抗病毒素和肿瘤制剂开辟了广阔的前景。但由于抗菌肽的分子量小,直接从动植物组织中提取天然抗菌肽时,分离提纯存在一定的困难,,而通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因时,由于抗菌肽分子量小,抗蛋白酶降解的能力差,表达产物可能对宿主有害,从而影响了基因的高水平表达。如何提高生产效率、降低成本成为抗菌肽基因工程研究亟待解决的问题之一钚墙5龋。目前不管是在微生物中的表达还是在植物细胞、昆虫细胞中表达,都存在着表达量偏低的问题。最近,通过融合表达的方法使抗菌肽在大肠杆菌中表达量有所提高晃龋。另外。与传统抗生素相比,某些抗菌肽的抗菌活性还不够理想,改造已有抗菌肽和设计新抗茵肽分子是提高其活性的有效途径踅ㄌ蔚龋。目前抗菌肽结构和功能的关系的研究,为设计新的多肽类型抗生素提供了理论依据,并且有了一些实质性进展,美国费城马普宁制药公司于年开始对青蛙皮肽抗菌肽结构分子设计,筛选出一种对病毒和肿瘤细胞均有较好杀伤作用的多肽分子,目前已经进入临床Ⅱ期试验。同时,抗菌肽转化植物的研究,为植物的抗性育种提供了一条有效途径。泛素枪惴捍嬖谟谡婧松镏械谋J匦约康男〉鞍祝氨基中山大学硕士学位论文
酸组成,分子量约为D壳八#核刂饕Mü。虽然本实验采取了拥有高效、成本低廉、培性。这个程序不是一次就能实现的,往往要经过多次循环、不断改进设计方案才能发现一个理想的改造抗菌肽g瘛⑷。此外,泛素作为分子伴侣参与核糖体的生物发生、细胞内吞等多种生理功能。泛素以分子内伴侣的形式能起到提高翻译水平和稳定蛋白的作用,通过泛素融合技术ǚ核鼗蚝推渌庠吹鞍椎幕蚪腥诤媳泶铮梢杂行У靥岣咄庠基因的表达。避免小分子蛋白在宿主菌中被降解4送猓捎谀芙ǚ核赜肴诤系鞍淄耆懈罘掷氲娜シ核鼗珼广泛存在于真核生物细胞内&,因此利用该泛素融合技术表达的多欣或蛋白,不需要进行融合蛋白分离处理,这在一定程度上简化了表达产物的后处理工艺。本实验室保有王丽博士和杜创硕士分别从棉铃虫幼虫与甜菜夜蛾幼虫体内分离出的八蚼抗菌肽。虲嗫咕亩贾饕W饔于细菌,对许多种革兰氏阴性和阳性菌都有很强的抗菌活性。但目垢锢氏阳性菌的活性要高一些。相反目垢锢际弦跣跃幕钚砸8咭恍R此如果蚦北幌妇盏疾墙行У纳彼拦闫椎娜肭窒菌;·珻一—琈一馊中碌闹刈樵雍想模以使烁蛹钚浴⒙菪鳰端更加螺旋化、疏水,以期获养方便等诸多优点的甤泶锵低常矣τ昧朔核厝诤霞际酰且膊荒鼙V小肽分子的高效表达和纯化,甚至是大规模生产。而且进行分子设计的过程从了解改造对象的结构和功能;然后通过理论的方法提出抗菌肽改造或全新设计的方案;再到通过化学合成或分子生物学手段利用载体进行表