文档介绍：: 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 : 根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等,可以用来分离不同种类的蛋白质。一、基础知识 3、提取分离方法凝胶色谱法电泳法(一) 凝胶色谱法( 分配色谱法) : 大多数凝胶是由多糖类化合物(如葡聚糖或琼脂糖)构成的多孔小球体,内部有许多贯穿的通道。根据蛋白质相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 : ①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时, 相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道, 路程较长,移动速度较慢; ②相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。③依据的特性是: 蛋白质相对分子量的大小。 4. (二)缓冲溶液 : 在一定的范围内,凡是能够抵制外界的酸和碱的影响使原来溶液 PH值基本保持不变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液 PH值的影响, 维持 PH基本不变。 : 思考:说出人体血液中缓冲对。 NaH 2PO 4/Na 2HPO 4 H 2CO 3/NaHCO 3通常由 1-2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同 PH范围内使用的缓冲液。 :在本课题中使用的缓冲液是:__________ , 利用缓冲液模拟细胞内的 PH环境,保证血红蛋白的正常结构和功能,便于观察(红色)和科学研究(活性) 磷酸缓冲液 :其目的是: (三) (三) 电泳: 电泳: 1. : 概念: 带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 2. : 原理: ①许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离的基团,在一定的 PH下,这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小,形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度, 从而实现样品中各种分子的分离。二、实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 : (一)蛋白质提取和分离步骤(二)操作过程可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。(1) 红细胞的洗涤:去除杂质蛋白,利于后续血红蛋白的分离纯化. 1、采集血样 2、低速短时间离心(离心速度过高和时间过长,会使白细胞等一同沉淀,达不到分离的效果) 3、吸出血浆: 上层透明的黄色血浆。 4、生理盐水洗涤: 下层暗红色的红细胞+五倍体积的 %的 NaCl 溶液洗涤,搅拌 10min 5、低速短时间离心: 6、重复 3、4、5步骤三次直至上清液中不再呈现黄色:红细胞洗涤干净(红细胞洗涤干净的标志)。①目的:②操作: 洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。