文档介绍：免疫荧光实验步骤'V  b3e)h:r;*_4Q9A+c3Q:w  s:N(1)基本原理将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。(2)试剂与仪器5Y2?3[$T(a*gl    磷酸盐缓冲盐水(PBS):,    荧光标记的抗体溶液:,;q7p5o1`    缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油9份+    搪瓷桶三只(,)l    有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)l3{7b%d#x6N&A+:O    荧光显微镜l    玻片架l"G8o2~1W+M3s)_  B    滤纸l%J!b+F1F/|'v  vl    37℃温箱等。(3)实验步骤①,,10min后弃去,使标本保持一定湿度。②滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温一定时间(参考:30min)。③取出玻片,置玻片架上,,,,,每缸3-5min,不时振荡。)s5@&L%\'A$M([)@ ④取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。⑤立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:(-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光明亮;(+++--++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)或(-),即可判定为阳性。6q&{%p/r  ['b*V(4)注意事项%C#U2v$M9~$W&W 1)对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从10min到数小时,一般30min已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于37℃可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2℃的低温,延长染色时间。低温染色过夜较37℃30min效果好的多。!e*`/P;L"[4l5U4_ 3)为了保证荧光染色的正确性,首次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧光染色的干扰。①标本自发荧光对照:标本加1-,。②特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体。③阳性对照:已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。.Q'P!U+y's:Y4u 4)一般标本在高压***灯下照射超过3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。/D,i/