文档介绍：福建医科大学
博士学位论文
乙型肝炎病毒感染肝细胞癌患者中截短型中蛋白的研究
姓名:周飞
申请学位级别:博士
专业:内科学(消化)
指导教师:江家骥
2011-03
乙型肝炎病毒感染肝细胞癌患者中MHBst的研究

博士研究生: 周飞
导师: 江家骥教授
指导老师: 林旭教授

中文摘要
目的:分子流行病学方法检测肝癌患者中HBV病毒株MHBst的种类,并研究各种
MHBst的反式激活能力及对细胞的增殖、成瘤和凋亡影响。以免疫沉淀的方法筛选
MHBst167候选结合蛋白。探讨截短中蛋白在肝细胞内的可能存在的分子作用机制。
方法:应用多聚酶链反应(PCR)和Alu-PCR技术自HBV感染肝癌患者外周血和肝
癌组织中扩增S基因序列,并进行pMD18-T载体的TA克隆,随机选择部分克隆进行
DNA 测序并对测序结果进行生物信息学分析。ailor Site-Directed
Mutagenesis System突变S蛋白的起始密码子,将S基因点突变成功的不同MHBst构建
真核表达载体和腺病毒表达载体,转染或感染细胞后Western-blot验证其蛋白的表
达。通过启动子激活萤火虫萤光素酶的表达研究不同MHBst反式激活功能。通过
CCK-8、软琼脂克隆形成及TUNEL方法观察不同截短型的中蛋白对细胞增殖、成瘤
及凋亡功能的影响。以免疫沉淀的方法筛选出MHBst167结合蛋白。
结果:成功自80例HBV感染肝癌患者的血清中获得700多个S基因的阳性克隆,通过
测序获得600条S区基因序列,发现7种分别在77,90,116,124,129,227,254处
氨基酸终止编码的MHBst;其中129,227,254三种MHBst出现的频率较高,分别为
15%(12/80),%(6/80)和20%(16/80);12例MHBst129全为C基因型,6例MHBst227
只有1例为B基因型,其余为C基因型,而16例254只有1例为C基因型,其余均为B基
因型。Alu-PCR从30例肝癌标本中检测出3例标本有S基因的整合,共发现了9种整合
位点。对8种不同MHBst和完整中蛋白成功进行了小蛋白起始密码子的突变。构建了
、p3xflag-cmv-10真核表达载体,并成功获
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病毒液。获得了能够分别表达SV40、c-fos、c-myc启动子的细胞株。不同MHBst的
反式激活能力、增殖及克隆形成能力不同。MHBst167可以通过TRAIL诱导产生细胞
凋亡并可以被阻断剂PD98059。免疫沉淀方法获得了相互作用蛋白醛缩酶B。
结论:HBV感染肝癌患者血清中存在7种不同类型MHBst,以C基因型出现的种类比
较多。HBV感染肝癌患者发生S基因整合较少,且为随机整合,但其整合可能涉及
细胞的增殖、凋亡等生物学功能。不同类型的MHBst有反式激活能力,并对细胞的
增殖及凋亡的有一定影响。免疫沉淀筛选出了醛缩酶B可与MHBst167蛋白相互作
用,为下一步研究提供新的线索。

关键词乙型肝炎病毒 S基因 MHBst 整合生物学功能

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Study truncated middle surface proteinof hepatitis B virus on
hepatocellular carcinoma

Candidate for doctor Zhuo Fei
Tutor Jiang Jiaji
Instructor Lin Xu

Abstract
OBJECTIVE:To study the types of MHBst in hepatocellular carcinoma patiens and
MHBst biologic funcation in hepatocytes.
METHODS:The S region of HBV was amplified by polymerase chain reaction (PCR)
method from 80 cases of hepatocellular carcinoma, and the PCR products were cloned
into pMD18-T vector and sequenced