文档介绍：论文评阅人糏粝瓤群痿瘤耋年日广州学位申请人导教师医学微生物学胡族琼教授答辩委员会主席答辩委员会成员郭明秋曹虹熊静波江振友副教授课题来源:广东省科技攻关项目瓽专业称指龙北国赵卫江丽芳第一军医大学级硕士学位论文谧床《綧目寺”泶锛氨泶锏鞍卓乖钚匝芯名—
冠状病毒区的克隆表达及表达蛋白抗原活性研究硕士生:胡族琼导师:龙北国赵卫摘要一、研究背景和目的冠状病毒瓹且恢中孪值牟≡⑸铮粲诔沧床《灸蛋白,它跨膜双分子层危贪被嗽谀ね猓然嗽谀つ诔埃个:、冠状病毒科篊⒐谧床《臼,基因组为单链正瓹可引起严重急性呼吸综合征,拘郧浚劳雎矢摺J追⒉±于年月出现在中国广东,疫情很快波及全球。目前,暂时得到控制,但在防治中许多关键问题尚待解决,如瓹入侵细胞及致病机制、特异性抗病毒药物、快速诊断试剂和疫苗的研制等。研究表明,冠状病毒鞍棘突蛋白蚆蛋白さ鞍具有免疫原性,能够诱导中和抗体产生,。鞍是最丰富的结构氨基酸组成,被认为是与核蛋白体作用的区域‘。⑾职被岜湟熘要发生在膜外和跨膜区域,膜内区域变异极少。对—鞍椎腂细胞抗原表位进行预测,结果表明鞍椎腂细胞抗原表位%以上都位于白膜内区鞍A碛醒芯空咴げ猓琈蛋白所含赴せ畋砦恢饕<%,即主要集中在蛋白区域内‘”。所以,就抗原活性而言,蛋白应是鞍椎拇砬危襇鞍椎氖杷性小于鞍椎氖杷裕子诖罅刻逋獗泶铩R虼耍鞠钛芯拷ò械鞍姿—谧床《綧目寺”泶锛氨泶锏鞍卓乖钚匝芯
二、研究方法为蛋白。对冠状病毒蚰つ诓糠区欣┰觥⒖寺。谠核系统中表达,表达蛋白纯化、复性后,对其抗原活性进行初步研究。⒏軬峁┑腟狢株蜃樾蛄校设计扩增引物,以本室分离的昊蜃槲D0澹┰鯩基因,构建克隆载体—ü齈方法分析鉴定。⒋覩略闟瓹序列,分别输入砑中的砑校厝基因片段,翻译成氨基酸序列。利用软件将扩增的蛴胂略氐闙基因核苷酸和氨基酸序列进行比较,选定和闟瓹的代表株。利用砑訥、和甑腗蛋白进行抗原表位及菪行脑げ猓⒈冉洗巳问的差异。⒏菪蛄蟹治鼋峁《∕基因膜内区即第位核苷酸为目的序列。根据闙基因序列设计引物,在引物两端加上盖形坏悖詐柿ND0謇┰鯩危又羛猅载体,得到刈榭寺≡靥濉⒔玴与—分别经盖泻罅樱菇ㄈ合表达载体狹;拗骶鶥ü盖小方法鉴定后测序。⒗肐盏急泶铮琒—电泳及—分析对表达蛋白进行初步鉴定。⒂呕盏急泶锾跫@帽湫约蛩厝芙獍澹谏涎埃结合缓冲液浠胶馐髦菌液裂解后结合至鳌合层析介质,以的咪唑漂洗杂蛋白,以倪溥颉⑾赐阉俣萳倍树脂体积/赐涯康牡鞍住⒔ù炕鞍紫∈椭“痬捎弥鸩酵肝龇ā保鸩饺コ湫约粒复性体系中加入サ谋砻婊钚约以稳定复性中间体,《綧目寺”泶锛氨泶锏鞍卓乖钚匝芯疿.
三、研究结果复性中凝聚。加入氧化还原剂趸凸入赘孰暮突乖凸入赘孰通过巯基氧化形成正确的分子内二硫键‘,整个实验操作在低温℃陆小⒗酶葱訫鞍酌庖咝挛骼即蟀淄茫竦枚嗫寺】固澹敫葱訫白进行间接—分析。对复性蛋白与兔抗人类普通冠状病毒和、疑似病人血清、健康人血清进行间接⑽A私釳鞍椎娜任榷ㄐ裕尤雀葱訫鞍字浚后,再与兔抗复性蛋白的多抗血清进行间接从Α┰黾翱寺谧床《綠株颍琈基因全长牍噬献钤绻ú嫉腟狢株蛲葱晕ィ果已登录锹己盼狝R訫基因为模板,扩增并克隆区,区序列大小为兄罩姑苈胗瑁嗦个氨基酸,与—株区同源性为ァS胂略氐闟冠状病毒区比较,仅有甑腗隚株有非同义突变。猯—亲水性、.砻婵赡苄浴—抗原指数三参数综合预测方案预测蚑株駼细胞抗原表位。结果表明,龆局闙蛋白可能的赴乖砦挥ヒ陨衔挥诘话被嶂螅次挥贛鞍浊蚰冢曳植记蛲耆嗤株白菪行囊餐耆嗤⑼ü呕泶锾跫琾—可在大肠杆菌懈咝П泶锶诤蛋白,分子量约为泶锏娜诤系鞍滓园逍问酱嬖谟谙赴手校菌体总蛋白的%左右,融合蛋自含有羑标签,有利于纯化。⑼ü髡炕跫行Ъ跎倭嗽拥鞍孜廴荆康牡鞍状慷却笥ァ⒏葱院螅竦昧司哂猩锘钚缘哪康牡鞍住⒁愿葱缘哪康牡鞍酌庖咝挛骼即蟀淄媚懿嗫寺】固澹康牡鞍啄与该抗体发生反应,但不能与兔抗和全病毒多克隆抗体发生抗原抗冠状病毒区的克隆表达及表达蛋白抗原话性研究
四、结论关键词:冠状病毒鞍譓寺”泶锟乖钚体反应;可与部分疑似病人血清发生抗原抗体反应,不与健康人血清发生任何反应。⒓尤雀玫鞍字螅隡鞍卓雇玫亩嗫寡G褰屑浣从Γ从峁R跣浴⑸镄畔⒀Х治鼋峁崾荆琈狹蛋白中赴乖砦幌喽约中区段。⒐菇ǖ脑酥刈楸泶镏柿/,经诱导后,可表达以包涵体形式存在的融合蛋白,分子量约为×榘彼岜昵┯欣诘鞍初步鉴定与纯化。⑼ü葱裕竦镁哂猩锘钚缘腗鞍住C庖咝挛骼即蟀淄貌嗫梗蛋白及其多抗间可发生抗原抗体反应,表明获得的蛋白具有良好的抗原活性。蛋白不与兔抗和血清发生反应,推测—蛋白可能与和无交叉抗原。蛋白与部分疑似病人血清反应,不与健康人血清反应,提示蛋白有可能作为诊断抗原检测,可能不存在隐性感染形式。鞍妆患尤群螅辉儆胪每筂鞍锥嗉垩G宸⑸乖固宸从Γ推测该蛋白可能为构像依赖性抗原而非线性依赖性抗