文档介绍：广州医学院
硕士学位论文
蝙蝠SARS样冠状病毒Spike蛋白受体结合域在Bac-to-Bac杆状病
毒表达系统中的表达
姓名:谢天炽
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:肖洪广
20100501
广州医学院硕士学位论文
蝙蝠 SARS 样冠状病毒 Spike 蛋白受体结合域片段在
Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统中的表达
硕士研究生:谢天炽
导师:肖洪广教授
中文摘要
目的:
SARS 冠状病毒表面的刺突蛋白(Spike,S 蛋白) 可与宿主细胞上的病毒受体血
管紧张素转化酶 2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)结合,介导病毒进入细胞。
S 蛋白上的受体结合功能域(Receptor Binding Domain,RBD)是能与 ACE2 稳定
结合的最小功能片段,在病毒的跨宿主传播中发挥了关键作用。
在 SARS 冠状病毒溯源的研究中,研究人员在蝙蝠体内发现 SARS 样冠状病毒
(Bat SARS-LcoV),但由于 Bat SARS-LCoV 不能在现有的细胞培养体系中有效扩
增和分离,限制了直接利用活病毒对细胞或动物模型感染从而进行跨宿主传播机制
的研究工作。本研究利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统对蝙蝠 SARS 样冠状病毒(Bat
SARS-LcoV)S 蛋白的 RBD 片段进行融合表达,并初步探索其表达动力学和纯化
条件,旨在为进一步研究 Bat SARS-Like-CoV 在动物间的传播路线和跨种属传播机
制提供实验基础,亦为进一步研究 Bat SL-CoV S 蛋白的抗原性和免疫原性提供基础
材料。
方法:
1、pFAST-Bat-RBD 供体质粒的构建:以蝙蝠 SARS 样病毒 S 蛋白基因第 964-1542
位核苷酸为目的片段设计引物,在反向引物上引入 FLAG 融合蛋白标签,通过
PCR 获取大量目的基因,并通过 T-A 克隆连接到 pMD18-T 载体,再通过亚克隆
手段将目的基因正确插入到 pFAST-HTB 的多克隆位点,以构建出
pFAST-Bat-RBD 重组供体质粒。
2、重组杆状病毒的产生和滴度测定:以重组供体质粒 pFAST-BAT-RBD 转化 E. coli
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中文摘要
DH10Bac 感受态细胞,可使其所带的目的基因 BAT-RBD 与 E. coli DH10Bac 细
胞内的杆状病毒基因组(Bacmid)发生转座重组。将重组的杆状病毒基因组
Bacmid-BAT-RBD 转染 sf9 昆虫细胞,即可产生重组的杆状病毒。通过检测病毒
的半数致死计量(TCID50),确定病毒的滴度。
3、重组蛋白 BAT-S-RBD 的产生和鉴定:用高滴度的病毒液以合适的感染复数
(MOI)感染昆虫细胞,72 小时后收集细胞和培养上清液作 SDS-PAGE 及
Western Blot 检测以明确蛋白表达的定位。并对重组蛋白的表达作时间和 MOI
优化,通过镍离子螯合树脂纯化重组蛋白。
结果:
1、质粒 pFAST-Bat-RBD 经双酶切、PCR 鉴定和基因测序,结果证实克隆的目的基
因正确插入到供体质粒,其序列与蝙蝠 SARS 样病毒 S 蛋白基因 964-1542 片段
完全吻合,提示供体质粒 pFAST-Bat-RBD 构建成功。
2、重组杆状病毒基因组 Bacmid-BAT-RBD 的 PCR 检测结果表明,目的基因已正确
插入到杆状病毒基因组中;细胞转染杆状病毒基因组后产生典型病变,以及稀
释的培养上清液能使正常细胞产生相同病变,表明重组病毒成功产生;通过测
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定病毒的半数致死计量(TCID50),得出 P1 病毒的浓度为 ×10 PFU/ml,P2
病毒液的浓度为 ×107 PFU/ml,P3 病毒液的浓度为 ×108 PFU/ml。
3、SDS-PAGE 及 Western Blot 检测结果表明,昆虫细胞感染重组杆状病毒后,成功
产生了重组蛋白 BAT-S-RBD,其分子量约 26kDa,且重组蛋白只在细胞内表达,
并不能分泌到培养基中。重组蛋白表达的最适合 MOI 为 2;表达峰值在感染病
毒 56 小时到 64 小时之间;可通过镍离子螯合树脂纯化重组蛋白。
结论:
本研究成功构建了包含目的基因的重组杆状病毒,可以在昆虫细胞系中有效产
生重组蛋白,并初步优化了重组蛋白的产生和纯化条件。为进一步研究蝙蝠 SARS
样冠状病毒在动物间的传播路线和跨种属传播