文档介绍：河南大学
硕士学位论文
冬凌草甲素的药代动力学和组织分布研究
姓名:郑海娜
申请学位级别:硕士
专业:药物分析学
指导教师:仲平;李吉学
2011-05
摘要
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)作为一种中枢退行性疾病,是老年痴呆的
最主要形式。依据最新的统计结果,世界上大约有 2700 万人口受到该病的影响。目前,
淀粉样蛋白级联假说(Amyloid Cascade Hypothesis)是一种主流的关于 AD 发病机制的
推测。该假说认为患者脑内堆积过多的β淀粉样多肽是造成 AD 的最根本原因。1999 年,
Schenk 等首先开展了以 Aβ为靶点的 AD 主动免疫治疗研究,将人纤维化的 Aβ1-42(简
称 Aβ42)多肽联合弗氏佐剂免疫 APP 转基因小鼠 Tg2576 后,小鼠体内产生了针对 Aβ42
的抗体,减少了大脑内的淀粉样斑块,改善了认知能力。随后,动物模型上的其他相关
研究表明AD的主动免疫治疗策略是有效的,但之后的AN-1792临床试验结果表明Aβ42
中存在的 2 个 T 细胞表位(17-21,29-42)诱导产生的 T 细胞免疫反应使得受试者出现
了急性脑膜炎症状。目前关于 AD 主动免疫的研究更倾向于使用 Aβ42 的 B 细胞表位
(1-15)并去除有害的 T 细胞表位,既让疫苗达到促进抗体生成的目的,又从根本上避
免之前临床试验所产生的不良反应。因此,我们在此理论基础上进行了破伤风毒素片段
作载体分子介导的阿尔茨海默病 B 细胞表位重组亚单位疫苗和核酸疫苗的研究工作。
首先进行了破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病 B 细胞表位重组亚单
位疫苗的研究,设计了 3 种融合多个 Aβ1-15(简称 Aβ15)串联基因、PADRE 基因和
破伤风毒素重链 C 端(简称 TTC)基因的重组蛋白原核表达载体,实现了重组融合蛋
白在大肠杆菌中可溶性表达并成功地纯化得到了电泳级纯度的重组蛋白。然后将纯化获
得的重组蛋白免疫普通 Balb/C 小鼠,测定的抗 Aβ特异性抗体水平结果显示重组蛋白免
疫动物后能够诱导小鼠产生高水平的 Aβ特异性抗体,并且通过血清抗体的亚型分析和
脾细胞增殖实验结果提示免疫反应完全偏向于 Th2 型。斑点杂交实验结果表明产生的抗
Aβ抗体倾向于与 Aβ寡聚体结合,与纤维状 Aβ结合能力较弱。进一步将其中一种重组
蛋白免疫 APP 转基因 AD 模型小鼠,实验结果显示重组蛋白在模型小鼠中仍然具有良
好的免疫原性,免疫特性与普通 Balb/C 小鼠相似。行为学实验评价结果显示免疫后小
鼠认知能力得到了一定改善。小鼠大脑组织免疫组化实验结果表明免疫组小鼠 Aβ斑块
明显减少。以上实验结果提示重组蛋白作为预防或治疗 AD 的候选亚单位疫苗具有良好
的应用前景。
IV
在重组蛋白亚单位疫苗研究的基础上,进行了破伤风毒素片段作载体分子介导的阿
尔茨海默病 B 细胞表位核酸疫苗的研究。设计了 2 种融合 6 个 Aβ1-15 串联基因、PADRE
基因和破伤风毒素重链 C 端基因的 DNA 真核表达载体作为 DNA 疫苗。经 IFA 检测表
明得到的 2 种真核表达载体均能使 Aβ15 和 TTC 基因在真核细胞中得到有效地表达。
DNA 疫苗免疫普通小鼠诱导生成了较高水平的抗 Aβ抗体,并且免疫反应完全偏向于
Th2 型。斑点杂交实验结果仍然提示设计的 DNA 疫苗产生的抗体倾向与 Aβ可溶性寡聚
体结合。DNA 疫苗免疫 APP 转基因 AD 模型小鼠后,也产生了良好的免疫反应,并且
免疫组小鼠大脑组织内的 Aβ斑块明显少于未免疫组小鼠,提示该 DNA 疫苗可能拥有
较好的免疫预防效果,可作为 AD 疫苗的一种新发展方向。
综上,本研究设计和制备了 3 种重组蛋白亚单位疫苗和 2 种重组核酸疫苗,实验结
果表明各疫苗在普通 Balb/C 小鼠体内产生了高水平的针对 Aβ42 的特异性抗体,并且有
效地避免了 Th1 型免疫反应,免疫反应完全偏向于 Th2 型。斑点杂交实验表明产生的
抗体倾向于与 Aβ寡聚体结合,提示抗体可能针对毒性较大的 Aβ寡聚体拥有更好的清除
或中和能力,这一免疫特性对疫苗的下一步深入研究具有重要意义。疫苗免疫 AD 转基
因小鼠以后,产生了同普通 Balb/C 小鼠的相当的免疫效果,并且小鼠认知能力得到了
改善,脑组织内的 Aβ斑块明显少于未免疫组转基因小鼠。本研究首次证实了破伤风毒
素片段作载体分子介导阿尔茨海默病 B 细胞表位疫苗能够提高其免疫原性反应的可行
性。以上结果表明本研究设计和制备的这种新型重组 Aβ1