文档介绍：山东省医学科学院
硕士学位论文
淡色库蚊细胞色素P450基因的克隆与初步功能鉴定
姓名:程鹏
申请学位级别:硕士
专业:病原生物学
指导教师:公茂庆
20090301
淡色库蚊细胞色素基因的克隆和初步功能鉴定专业:病原生物学研究生:程鹏导师:公茂庆研究员中文摘要淡色库蚊是多种病毒病和寄生虫病的主要传播媒介,是室内叮吸骚扰人类的研究一抗性机理研究提供模型,为防制工作提供理论依据。采用浸液法,用溴氰菊酯∞剂量对淡色库蚊Ⅳ龄幼虫用药筛选。研究二淡色库蚊细胞色素基因的分子克隆及不同期的表达鉴定为克隆淡色库蚊细胞色素瘅畹基因并对其进行表达差异的鉴定,对溴氰菊酯抗性品系溆壮嬷锌寺∠赴豍孟嘤Φ娜主要害虫,采用化学杀虫剂防治此类害虫具有相当长的历史,其优点是操作方便,迅速有效,因此在媒介昆虫防治中占有主导地位,曾为媒介昆虫和虫媒传染病的控制做出过巨大贡献。但由于蚊虫对环境高度的适应能力,频繁使用化学杀虫剂后,很容易产生抗药性,并且抗性程度增长快,抗性分布范围广,目前蚊虫对施用过的杀虫剂几乎都产生了不同程度的抗性,大大影响了它的杀虫效果。因此,及时掌握蚊虫抗药性的现状,研究其发生发展规律及治理对策是科学合理地进行化学防治的关键。因此,研究媒介抗药性产生的机制并进行适宜治理实乃当务之急。本研究拟从克隆抗药性相关基因入手,并对其进行功能鉴定,为探讨最终治理媒介抗药性奠定基础。本文从以下三个方面进行了研究。溴氰菊酯选育淡色库蚊抗药性的研究在实验室条件下选育拟除虫菊酯抗性品系,了解抗性产生、发展的规律,为结果表明,敏感品系淡色库蚊经溴氰菊酯处理代,。。,抗性水平呈近指数曲线上升:证明淡色库蚊对溴氰菊酯能在短时期内产生抗性并且迅速发展;选育的淡色库蚊抗溴氰菊酯品系与敏感品系的毒力回归线平行,表明抗性品系选育成功。本研究采用技术和策略,从淡色库蚊/件进行生物信息学分析,并用定量桶攵縍治雒舾小⒖剐云废滴
检测重组表达载体糍ぃ:彬阴卵力在稳定转染的蚊细胞内高研究三淡色库蚊细胞色素提示,基因与溴氰菊酯抗性相关,可能为溴氰菊酯抗性相关基因。的表达水平及对蚊各期进行表达差异鉴定。结果表明,成功克隆出基因。基因全长,开放阅读框为,编码霭被帷P蛄蟹治鱿允荆没蛴胍驯ǜ娴娜毡镜闹戮库蚊赴豍疦有%同源性,并具有所有细胞色素基因的保守性特征,一个膜锚定信号、两个还原酶结合位点、一个典型的血红素蛋白结合位点和基序等。定量结果表明,在淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系中表达水平高于敏感品系,提示基因可能与杀虫剂抗药性相关。在淡色库蚊各个发育阶段也有不同的表达,以溆壮姹泶锼阶罡摺基因的初步功能研究为鉴定细胞色素基因与淡色库蚊溴氰菊酯抗性的关系,本研究扩增基因编码区,构建蚊细胞表达载体疺疌H疚/细胞。稻瘟菌素稳定筛选和单克隆化后,细胞扩大培养,然后用和鉴定稳定转基因细胞的转录表达。不同浓度的溴氰菊酯处理稳定转基因细胞及对照未转基因细胞和转无关基因细胞后,用ā⑾赴で线测定、流式细胞仪及显微镜下观察细胞存活率、细胞增殖速度、细胞周期及细胞生长情况等。结果显示,成功构建昆虫细胞表达载体并建立稳定转染细胞系,—表达。不同浓度的溴氰菊酯处理转染细胞后,.;细胞的增值速度也快于对照细胞;转染基因细胞的形态、密度未见明显变化,而对照细胞颗粒变粗、密度降低,但细胞周期未见明显变化,也未见细胞凋亡现象。初步研究结果关键词:淡色库蚊,溴氰菊酯,杀虫剂抗性,细胞色素,逆转录榷表达淡色库蚊细胞色素基因的克隆和初步功能鉴定\
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