文档介绍：第三军医大学
博士学位论文
LEDGFp52对大鼠视网膜神经节细胞作用研究
姓名:赵海生
申请学位级别:博士
专业:眼科学
指导教师:王一
20070501
对大鼠视网膜神经节细胞作用研究摘要反应,轴突再生的难题也就迎刃而解了。晶状体来源的上皮生长因子某种生长和营养因子的单一研究,迄今为止,还未能找到一种因子能对提供持【背景】提高损伤后视网膜神经节细胞存活和再生能力的研究是眼科和神经生物学科共同关注的热点和焦点。具有神经保护性效能的神经营养因子是实现视觉系统中枢神经修复基因治疗和移植的前提和物质基础。然而,既往的研究多集中在续的营养支持作用足以克服其周围的再生抑制环境而促进损伤的轴突再生。如果能寻找到某种在转录水平或转录前作用的因子,则该因子有可能启动さ募词琇晷路⑾值囊恢中碌纳ぁ⒄掣健⒎只⒖沟亡和存活因子,它能提高多数细胞生长粘附能力、促进其分化、延长其存活。基因位于人类染色体,该基因选择性的剪切而产生两种蛋白,即和蛋白。相比而言,只是一个弱的转录辅活化子。最近的研究表明能促进多种细胞的生长与存活,譬如对晶状体上皮细胞、视网膜光感受器细胞、视网膜色素上皮细胞所发挥的生长刺激和促进存活效应。进一步的研究发现谀阅诘姆⒂扒虮泶铮崾酒洳斡肷窬掀じ上赴只吧经发生。因此,有专家提议将魑J油ぜ膊〉闹瘟菩缘鞍缀蜕窬Q蜃转染的候选分子。基于具有一定的眼部保护作用的研究前提、联系可能比镅ё饔酶康纳镄畔⒀гげ狻⒔岷瞎噬隙这一转录活化子研究很少的事实和视神经再生研究中积极寻找具有神经保护和生长促进效能神经营养因子的要求,我们选择作为研究的目标。那么,作为一个新发现的因子,它是否能对鸬缴窬;ず蜕ご俳饔呢訰神经元生长相关基因和蛋白又有什么影响呢庥写谖颐峭ü笛研究来明确。【目的】在原代大鼠培养的基础上进行基因和蛋白两个水平正负双向调控实验,观察它们对大鼠突起数目及轴突长度、窬L匾煨韵关基因和蛋白的调控,全面了解基因和蛋白对大鼠生长的影响,为研发更有效的ず陀Q蜃拥於ɑ。L剿魇由窬鹕诵薷吹男峦揪短峁实验依据。第三军医大学博士学位论文
扪G逄逑蹬嘌鳵捎肐和细胞免..疞繪蛃—×疞H窘鳵,分与拖俨《;构建基因原核表达载体、诱导表达及纯化蛋白;细菌内同源重组法构建基因腺病毒载体、体外表达及制各病毒;构建甃婧吮泶镌靥濉⒓ǜ迷靥宀⒓觳馄涠蛋白的抑制率。蚝偷鞍锥源笫驲耐黄鹗考爸嵬怀ざ鹊骺刈饔玫墓鄄欤悍为实验组和对照组,实验组在大鼠培养蠓直鸾獿∥和.×’蜭尤隦奈扪G迮嘌校贚榈枷陆别在处理后、、在相差显微镜下观察。设阳性对照组∥和空白对照组患哟硪蛩,观察时相点同上。对照组及实验组的每组观察孔数为孔,重复巍<觳庵副辏篟嵬怀ざ群偷ジ鱿赴耐黄鹗俊7治软件:枷穹治鱿低场蚝偷鞍锥訰神经元生长相关基因和蛋白调控效应的研究:处理因素及分组同上。检测指标:主要采用和细胞免疫荧光化学检测技术进一步研究对窬Iは喙氐腉.、.。分析软件:绦虬攵糠治龈鞲瞿康幕蛟趍降南喽含量,以待测基因与相应内参照光密度比值计算相对系数;..绦半定量分析各个目的蛋白的平均荧光强度相对数值。⑽扪G宓腘驧培养基是一种较好的培养体系;基因及其蛋白在均有表达。⒗没蛑刈榧际踅玶蚬菇ㄓ谠吮泶镌靥錺“中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确,通过诱导其在大肠杆菌谢竦每扇性形式表达,蛋白表达量占菌体蛋白总量的.%。甧蛋白能够特异性与產岷稀狽瓸甊方法进行纯化后的,终浓度达ǎ甿ǎ治銎浯慷却ァ⒊晒獿蚱窝强寺〉较俨《敬┧笾柿瓹上构建腺病毒穿梭载体瓹⒔俨《敬┧笤靥錺瓹基因重组腺病毒载体,将甃侍宸ㄗ;【方法】【结果】结果显示第三军医大学博士学位论文
⒊晒菇↙騃矾扇恼婧讼赴泶镌靥澹刈橹柿WH颍甃~,并能够在真核细胞中获得高效稳定的表达;利用驛际蹩沙晒菇ㄒ种表达的小干扰疉重组体,该重组体使蛋白明显下调%。细胞包装产生重组腺病毒.,滴度可达甃。。细胞小时,检测到蛋白表达的改变,锄够绦半定量分析蛋白明显下调了%。诨蛩胶偷鞍姿骄傻骺豏ぃ硐治U虻鹘赗轴突显著增长,负向调节轴突显著缩短,而且正向调控时有高峰效应。荝树突化因子,同时也是嵬谎由煲蜃印诨蚝偷鞍琢礁鏊蕉訰神经元生长相关的基因/蛋白狶和的表达均有显著的调控作用,表现为正向调节神经元生长相关基因/蛋白表达升高,负向调节神经元生长相关基因/蛋白表达降低。【结论】状稳妨⒘薒蚣捌涞鞍自赗谋泶铩没蛑刈榧际醭晒竦胷鞍祝张ǘ却耀.~,纯度达.%;经细菌内同源重组成功制备的重组腺病毒,滴度可达甃蚝偷鞍啄芟灾骺卮笫驲ジ鱿赴黄鹗考爸嵬黄骄度,其作用强于。甃荝树突化因子,也是嵬谎由煲蜃印甃蚝偷鞍淄ü骺豏神经元生长相关的基因/。甃蛟诘骺豏树突化时