文档介绍：华中科技大学
硕士学位论文
硒蛋白S和硒蛋白K在内质网应激中的调节作用
姓名:杜少卿
申请学位级别:硕士
专业:无机化学
指导教师:黄开勋
2010-10-23
华中科技大学博士学位论文
摘要
内质网(ER)是哺乳动物细胞中一个极为重要的细胞器,既是蛋白质合成和翻译
后修饰、折叠与装配的重要场所,也是细胞第二信使 Ca2+的贮存器,还与糖类、脂
类和甾体类激素的合成、血糖浓度的调节、解毒、转运、同化等有关。大量研究显
示内质网应激与许多疾病有关,如脑局部缺血损伤、神经退行性疾病、糖尿病等。
该领域已成为当前生命科学研究的热点之一。
硒是哺乳动物中的一种必需微量元素,主要以硒蛋白的形式存在于生物体中,
在许多生理过程中发挥着十分重要的作用。在 25 种哺乳动物硒蛋白中有 7 种定位于
内质网上,它们包括 15-kDa 硒蛋白、II 型脱碘酶、硒蛋白 K、硒蛋白 M、硒蛋白 N、
硒蛋白 S 和硒蛋白 T。除了 II 型脱碘酶外其余硒蛋白的功能未知或知之甚少。因此,
开展内质网硒蛋白的研究对于深入了解硒的生物学功能具有重要的科学意义和潜在
的应用价值。
本文以 HepG2 细胞为对象,研究了 SelS、SelK 在内质网应激中的作用,重点探
讨了 SelS 和 SelK 基因沉默对内质网应激试剂诱导细胞内质网应激和细胞凋亡的影
响,主要结果如下:
(1)补硒和 SelS 基因沉默对β-巯基乙醇诱导内质网应激的影响
采用 MTT 检测、荧光定量 PCR 技术、免疫印迹、Hoechst 33342 染色和流式细
胞仪研究了补硒和 SelS 基因沉默对β-巯基乙醇诱导内质网应激的影响。结果表明,
100 nM Na2SeO3 或 10 mM β-ME 单独作用可分别显著增加 HepG2 细胞中 SelS 蛋白的
表达量至 130%和 161%;100 nM Na2SeO3 还可显著降低β-ME 诱导的细胞死亡和凋
亡。提示补硒可能通过增加 SelS 等硒蛋白的表达抑制β-ME 诱导的内质网应激对细
胞的损伤。进一步通过基因沉默技术分别抑制 SelS mRNA 和蛋白质表达至 23%和
46%后,可分别使 10 mM β-ME 和 10 µg/mL Tm 作用 HepG2 细胞时细胞的存活率与
对照组相比显著下降 10%和 14%;10 mM β-ME 作用 SelS 基因沉默组细胞 24 小时后,
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华中科技大学博士学位论文
GRP78 蛋白水平与β-ME 作用于正常细胞相比显著增加,说明 SelS 在抵抗β-ME 诱
导的内质网应激方面发挥重要作用。且当 10 mM β-ME 作用正常细胞后,通过细胞
核染色可以观察到少量细胞的细胞核固缩,出现早期凋亡现象;而当 10 mM β-ME
作用于 SelS 沉默组细胞后可以观察到大部分细胞核固缩,部分细胞核碎裂成小块,
呈现典型的凋亡形态,细胞凋亡现象较 10 mM β-ME 作用正常细胞有显著的增加,
通过流式细胞仪检测其凋亡率也显著升高,可见细胞中 SelS 的沉默可使细胞对β-ME
引起的凋亡更加敏感。通过透射电子显微镜观察到 SelS 的沉默得到同样的结果,这
进一步表明 SelS 对于保护 HepG2 细胞抵抗内质网应激诱导的凋亡具有重要作用。
(2)SelS 基因沉默对内质网上其它硒蛋白表达的影响
通过基因沉默和荧光定量 PCR 技术检测了 SelS、SelK 或内质网上非硒蛋白
Derlin-1 沉默对内质网其它硒蛋白表达的影响。结果表明,SelS 基因沉默的时候内质
网上的硒蛋白 SelK、 SelT、 SelN 和 Sep15 mRNA 表达也被抑制,而非硒蛋白 Derlin-1
的表达不受 SelS 基因沉默的影响;而 SelK 或 Derlin-1 沉默则对内质网上的其它硒蛋
白的表达没有影响。通过 BLAST 检索了 SelS siRNA 序列的特异性,结果表明 SelS
siRNA 序列与内质网上其它硒蛋白没有同源性。在此基础上,研究了 SelS 与 SelK
在内质网应激条件下的相互影响,结果表明当细胞中 SelS 表达沉默后,10 µg/mL Tm
作用下 SelK mRNA 表达与正常组相比显著增加;与之相反,当细胞中 SelK 表达沉
默时,10 µg/mL Tm 作用下 SelS mRNA 表达与正常组相比显著增加。说明 SelS 基因
沉默可导致内质网上的其它硒蛋白表达的下降,并且 SelS 与 SelK 生物功能之间可能
有互补作用。
(3)SelK 在内质网应激中的调节作用
基于 SelK 和 S