文档介绍：复旦大学硕士研究生学位论文丙型肝炎病毒非结构蛋白影响细胞周期机制的研究专业病原生物学硕士研究生邵俊杰导师袁正宏研究员导师组成员顾建新教授童文燕博士二零零五年五月复旦大学上海医学院教育部、卫生部医学分子病毒学重点实验室本课题承自然科学基金徒逃抗歉山淌
硕士学位论文中文摘要丙型肝炎病毒非结构蛋白影响细胞周期机制的研究检测蛋白表达后参与细胞周期/谝籹期调控的相关硕士生:邵俊杰导师:袁正宏丙型肝炎病毒琀5ス啥链《荆腥救颂后易引慢性肝炎、肝硬化、甚至肝癌,然而迄今尚不清楚其详细机制。一般认为,腥舅拗飨赴竽芤砸恢址巧毕赴男问皆谙赴诟粗疲⑼ü铣捎泄病毒蛋白、引起细胞功能改变而导致肝硬化、甚至肝癌的发生。已有研究表明,慕峁沟鞍譪⒎墙峁沟鞍譔可能参与此过程,前者可能通过抑制抑癌基因舳踊钚裕笳咴蚩赡苡肫浼羟性┗虿镉泄亍6栽贖复制中发挥重要作用的非结构蛋白,目前的研究主要集中在其多聚酶活性,尚无发现其与病毒致细胞病变的关系。本室曾发现在细胞内短暂表达后可使赴南赴芷谕V陀贕期,提示它有可能通过影响细胞周期、导致细胞功能的改变。鉴于胨拗飨赴嗷プ饔梦2《靖腥痉⑸⒎⒄沟幕础,进一步深入研究影响细胞周期乃至功能的详细机制,可能有助于揭示虏⒁鸶斡不⒏伟┑姆肿踊疲=徊窖兄朴行Э笻药物提供理论基础和实验依据。为此,本研究首先通过生长曲线实验验证非结构蛋白对细胞周期的影响。将赴üG寮⒍龇椒ㄊ瓜赴V陀贕期,然后转染非结构蛋白表达质粒,同时用空载体、无关蛋白及非结构蛋白的酶活性失活的突变体表达载体作为对照。结果发现,无论野生或突变型均可减慢细胞的生长速度,提示非结构蛋白确实可影响细胞的生长。在此基础上,本研究探讨了非结构蛋白影响细胞生长的分子机制。首先应用细胞周期激酶的变化情况。结果发现,蛋白在细胞内表达后总蛋白水平无改变,但磷酸化的水平有明显的下降,并与蛋白的表达量呈剂量依赖关系,提示的磷酸化受影响。为证实是否是通过调节蛋白而影响的磷酸化水平,分别应用舳颖ǜ嬷柿O低澈蚿抑制剂。结果发现,表达的蛋白在细胞内对舳踊钚晕廾飨杂跋欤辉硕貉宦畚中文摘要
为排除对细胞周期作用与其嗑勖富钚缘南喙匦裕芯苛薘制剂。结果发现,表达的蛋白在细胞内对舳杌钚晕廾飨杂跋欤辉加入种萍烈院螅琋粤姿峄疌囊种谱饔貌糠直换指矗崾綨对细胞周期的作用部分是通过返摹N7治鯟姿峄芤种坪笃湎游通路是否受影响,进一步应用钚员ǜ嬷柿O低逞芯縉泶锵赴的剑笛橄允荆鹤H綨鞍缀螅覩期进入诒匦璧腅转录因子水平受到了影响,提示转录因子氖头攀茏琛为研究对细胞周期的影响是否还通过影响其他,将表达质粒和空载体分别转染细胞,小时后应用检测调节/期到诘闹饕狢和相关的及调节细胞周期的主要抑癌基因鞍的表达情况。结果发现,与对照组相比,在表达细胞,蛋白表达水平有明显的下降,而抑癌基因鞍妆泶锼接幸欢ǔ潭鹊纳仙多聚酶缺失的突变体对B家蜃踊钚缘挠跋臁#峁⑾郑胍吧相似,瞬时转染多聚酶活性缺失突变体的细胞,其B家蜃踊性仍然受到抑制,进一步提示对细胞周期的作用与其多聚酶活性无关。为深入探讨非结构蛋白影响细胞生长的分子机制,对酵母双杂交试验筛选到的可能与发生相互作用的一个细胞周期相关的蛋白:辛搜芯俊C庖吖渤梁图す夤簿劢故笛橹な礜隒存在相互作用,。进一步在歉粗谱酉赴泄泶顲蛋白,则发现蛋白能够增强腔蜃楦粗谱酉赴诓《靖粗芌的水平。上述结果提示非结构蛋白有可能通过与蛋白的相互作用影响细胞周期并调控病毒复制。综上所述,,从而使细胞生长停滞于/凇R鹫庵窒窒蟮目赡芑埔皇峭ü鹘趐蛋白表达水平,另一方面可能是通过细胞蛋白介导。本研究的深入开展将为了解胨拗飨赴南嗷プ饔茫教諬的致病机制,寻找抗行У药物打下坚实的基础。关键词:丙型肝炎病毒嗑勖赶赴芷分子机相和坝【‘学位论史中立摘美
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丙型肝炎病毒非结构蛋白影响细胞周期机制的研究前言丙型肝炎病毒琀且恢秩蛐缘奈:θ死嘟】档闹要病原体。它主要通过输血、静脉注射、母婴垂直传播感染致病。全世界感染者约有冢夜母腥菊咴加嗤颍腥菊咧プNB愿窝祝其中%发展为肝硬化,%肝硬化患者甚至发展为肝癌。对其引起肝硬化、甚至发展为肝癌的机制目前了解不多,一般认为,腥舅拗飨赴竽芤砸种非杀细胞的形式在细胞内复制,并通过合成有关病毒蛋白、引起细胞功能改变而导致肝硬化、甚至肝癌的发生。近年束国内外众多实验室对引起肝硬化、甚至发展为肝癌的机制进行了研究,已获得具有一定意义的结果,目前已发现其结构蛋白可以抑制抑癌基因舳踊钚裕柚蛊涠訢的修复,导致细胞恶变¨;非结构蛋