文档介绍：浙江大学
博士学位论文
靶向抑制Survivin对肝癌细胞增殖和凋亡效应的研究
姓名:戴德坚
申请学位级别:博士
专业:外科学(普外科)
指导教师:陆才德
20050401
靶向抑制对肝癌细胞增殖和凋亡效应的研究中文摘要陆才德教授博士研究生:浙江大学医学院附属第二医院普外科戴德坚导师:发挥重要调节作用,过表达于常见的恶性肿瘤组织,而在正常分化组织中沉默,使其成为一个非常有吸引力的癌症治疗靶点。在肿瘤细胞内导入凋亡抑制因子拮抗物有可能成为肿瘤基因治疗中最诱人的策略之一。不少研究显示和抑制肿瘤细胞增殖,但在反义应用研究中,许多关键问题亟需解决。以其不同编码区为靶序列的反义寡核苷酸对表达抑制差异可能很大,必须通过体外和体内试验寻找安全有效的反义寡核苷酸序列,并确定剂量一反应曲线。其次,尽管对的结构了解得比较清楚和它的抗凋亡功能得到面角色和作用机制仍有待进一步阐明。更重要的是在不同肿瘤表达有很大差异,靶向抑制表达能否影响一些常见肿瘤生长必须通过更多的肿瘤的发生发展与细胞增殖和凋亡调节失控密切相关。最近研究发现凋亡蛋白抑制因子家族的最小成员在细胞增殖和凋亡的界面之间是一潜在的抗癌治疗靶,并且反义表达成功诱导肿瘤细胞凋亡首先,必须寻找抑制表达的有效靶位。公认,然而在细胞生命活动如凋亡、细胞周期和有丝分裂增殖中的界背景和目的链长,浙江大学博士学位论文
体外试验,并进而通过体内试验证实。诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物发挥杀伤作用的重要机制之一,而凋亡抑制技术可通过封闭凋亡基因的过表达,诱导凋亡,增强化疗敏感性。这正是当今要讨论的是敏感细胞系,而反义表达能否使耐药细胞系对化疗敏感,甚至对原耐受的化疗药物增敏有待进一步阐明。这对于预防肿瘤的发生发展及放疗均不敏感,预后很差,至今缺乏有效的治疗手段,亟需探索新的治疗方法。人肝癌组织,与肝癌细胞增殖和凋亡密切相关,也是其对放化疗不敏感的原因合物,进而探讨其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响:反义干扰抗凋亡功能对肝癌细胞的细胞周期、细胞分裂和亚细胞定位的影响,阐明过表达在肝癌细胞增殖和凋亡界面角色及作用机制;探讨基因表达与肝癌细胞耐药的关系及反义抑制表达恢复耐药肝癌细胞系对阿霉素的敏感性,阐明反义寡核苷酸和阿霉素的联合应用,可能是将来耐阿霉素肝细胞癌临床治疗的一种合理策略;建立肝癌裸鼠模型,验证反义复合物对肝癌细胞裸鼠体内移植瘤的生长影响,为肝癌及阳性肿瘤治疗提供新途径。基因的过表达导致了凋亡抑制,并与肿瘤化疗耐药有密切关系。反义备受关注的一种肿瘤耐药逆转的新策略。最近研究已经证明了反义抑制的表达能够增加多种肿瘤细胞系ǜ伟对化疗的敏感性,但这些研究主手术后抗复发治疗有着潜在的巨大价值。肝癌手术切除率低,复发率高、对化最新研究表明,广泛表达于琀蚐瓾雀伟┫赴导之一。本研究试图设计、筛选和确定能有效抑制肝癌细胞系表达的反义复浙江大学博士学位论文
应浓度为疞,此时表达水平下调了%。类似细胞生长抑制结果为盯研究一:特异反义复合物抑制表达对肝癌细胞增殖和凋亡效应的方法:根据⒍觀删设计程序和捶治觯げ夂腿范ㄒ系列一匆辶蛄柞9押塑账嵝蛄邪邢騭列。分别转染赴担琈法筛选出有效的反义寡核苷酸序列。通过改变反义寡核苷酸:脂质体:—嚷剩肦■实验,构建并优化能有效抑制肝癌细胞表达的反义复合物。ḿ觳庀胞生长情况。流式细胞术测定活性及凋亡率。电镜观察细胞形态学变化。结果:针对细胞毒性,故本实验选择反义复合物:。反义复合物:转染肝癌细实验所证实。与此同时,活性和凋亡率随转染时间延长而逐渐递增,、核浓缩和核碎裂。研究二:反义干扰抗凋亡功能对肝癌细胞细胞周期,细胞分裂和方法:用脂质体介导反义寡核苷酸转染肝癌细胞系Mü本课题分以下几部分研究不同区域的候选序核苷酸号为肭的反义寡核苷酸序歹是最有效的序列,而针对翻译起始恢玫男蛄蠭及其他翻译区序列蚔—序列均无效。反义寡核苷酸序歹:脂质体::为最有效的反义复合物,而反义复合物:一荒艽锏阶畲笮вΑ<谥侍逵星岫胞有效下调表达水平,呈剂量依赖关系,值为疞,。流式细胞术测定的方法和结果影响。,浙江大学博士学位论文
数的影响。用反向相差显微镜和电子显微镜观察细胞核形态学的变化。应用激结果:在反义复合物转染的赴校匆甯扇舠墓δ艿贾紧跟着细胞凋亡,低浓度处理可将细胞先后阻滞在诤虶疢期;高浓度时,诤虶疢期阻滞被加强,快速诱导细胞凋亡,并且细胞凋亡率随着药物浓度细胞中,细胞先出现了一个以多核多倍体为特征的细胞有丝分裂过失,紧接着一绿荧光染色的蛋白分子在未转染的细胞浆中清晰可见,并呈“斑研究兰:反义抑制表达恢复耐药细胞系疉对阿霉素的方法:采用阿霉素浓度递增法,建立人肝癌细胞多药耐药模型疉。ㄆ拦繦和疉对反义复合物和阿霉素的敏