文档介绍：实时荧光定量PCR技术的原理及应用
(Real time Quantitative PCR)
讲座提纲
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR的几种方法介绍
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR的几种方法介绍
实时荧光定量技术的应用
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法
实时荧光定量PCR 原理实时原理
常规 PCR技术:
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析
无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测
实时定量PCR技术:
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析
实时荧光定量PCR原理定量原理
介绍三个概念:
扩增曲线、荧光阈值、Ct值
如何对起始模板定量?
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
实时荧光定量PCR 原理----------- 扩增曲线
扩增曲线图:
横坐标:扩增循环数(Cycle);纵坐标:荧光强度
每个循环进行一次荧光信号的收集
荧光基团
荧光检测元件
实时荧光定量PCR 原理-------荧光阈值
荧光信号阈值(threshold ):
前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline),即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值
荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置:原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值,同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,
真正的信号:荧光信号超过域值
实时荧光定量PCR 原理-------Ct值
Ct值的定义:
PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数
C(t) value
实时荧光定量PCR 原理-------Ct值的重现性
横轴:PCR反映循环数
纵轴:荧光信号量
Ct值的特点:
相同模板进行96次扩增,终点处产物量不恒定;
Ct值则极具重现性
实时荧光定量PCR 原理--------- 定量原理
理想的PCR反应:
X=X0*2n
非理想的PCR反应:
X=X0 (1+Ex)n
n:扩增反应的循环次数
X:第n次循环后的产物量
X0:初始模板量
Ex:扩增效率