文档介绍：PCR扩增产物的克隆
平端连接法 实验原理 平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。
如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。
通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条 DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。
这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，在采用大量T4 DNA连接酶并配以5-10u
T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。
对于较短PCR产物，用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，以X-gal和IPTG筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。 实验材料 模板DNA 试剂/试剂盒 SauI Klenow片段 T4连接酶 仪器/耗材 移液器 移液器吸头 PCR小管 DNA扩增仪 电泳槽 电泳仪 台式高速离心机 实验步骤 一、PCR反应 1. 依次混匀下列试剂 （1）H2O：35 μl （2）10×PCR反应缓冲液：5 μl （3）25 mmol/L MgCl2：4 μl （4） 4种dNTP：4 μl （5）上游引物（引物1）： μl
（6）下游引物（引物2）： μl （7）模板DNA（约1 ng）： μl （8）混匀后离心5秒。 2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（ U），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。 3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟， 72℃延伸2分钟， 循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后， 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。 二、电泳 取10 μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。 三、PCR产物的纯化 扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。 1. 酚/***仿法 （1）取反应产物加100
μl TE。 （2）加等体积***仿混匀后用微型离心机10000 rpm离心15秒，用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次， 可除去覆盖在表面的矿物油。 （3）再用酚:***仿:异戊醇抽提二次，每次回收上层水相。 （4）在水相