14大肠杆菌基因工程研究报告.ppt

文档介绍：第十四章 大肠杆菌基因工程
四、 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策
第十四章 大肠杆菌基因工程
三、 大肠杆菌基因工程菌的构建策略
二、 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
五、 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
一、 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌基因工程
1、大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架
基因克隆表达系统成熟完善
繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定
被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
二、 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子
1
大肠杆菌基因工程
终止子
2
3
核糖体结合位点
4
密码子
5
质粒拷贝数
a. 启动子最佳距离的探测
目的基因
E
E
A
E
E
启动子
A 酶切开
Bal31酶解
目的基因
1
启动子
b. 启动子的筛选
Apr
ori
galK
pKO1
终止密码子
采用鸟枪法战略，将合适大小的DN***段
克隆到启动子探针质粒pKO1上
受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质
粒上报告基因galk的表达产物联合作用，
可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
含有外源启动子活性的重组克隆
1
启动子
c. 启动子的构建
-35 区序列
-10 区序列
PlL
PrecA
Ptrp
Plac
PtraA
Ptac
启动子
T T G A C A
G A T A C T
T T G A T A
T A T A A T
T T G A C A
T T A A C T
T A G A C A
T A A T G T
T T T A C A
T A T A A T
T T G A C A
T A T A A T
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
1
启动子
d. 启动子的可控性
P
乳糖启动子Plac的可控性：
O
P
O
高效转录
阻遏蛋白
诱导
乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）
野生型的Plac与其控制区Olac
偶联在一起，在没有诱导物
存在时，整个操纵子处于基
基底水平转录
底水平表达；诱导物可以使
启动子Plac介导的转录大幅
提高
1
启动子
启动子的可控性
Plac
乳糖启动子Plac的可控性：
O
Plac
O
高效转录
葡萄糖代谢
野生型的Plac上游附近拥有
代谢激活因子（CAP）结合
区，cAMP激活CAP，CAP
基底水平转录
结合启动子控制区，进而促
进Plac介导的转录。葡萄糖
代谢使cAMP减少，也能阻
遏Plac介导的转录。因此，
基因工程中使用的乳糖启动
子均为抗葡萄糖代谢阻遏的
突变型，即Plac UV5
CAP
cAMP
cAMP浓度降低
Plac UV5
O
高效转录
1
启动子
启动子的可控性
Ptrp
色氨酸启动子Ptrp的可控性：
Otrp
除去色氨酸
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏
蛋白复合物的阻遏，转录呈基底
状态。在培养系统中去除色氨酸
基底水平转录
或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），
便可有效地解除阻遏抑制作用。
在正常的细菌培养体系中，除去
色氨酸是困难的，因此基因工程
中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目
基因的表达
色氨酸
或加3-吲哚丙烯酸
高效转录
阻遏蛋白
（IAA）
Otrp
Ptrp
高效转录
Otrp
Ptrp
1
启动子