文档介绍：南方医科大学
博士学位论文
RCR扩增高GC含量DNA序列的引物设计策略
姓名:李莉艳
申请学位级别:博士
专业:细胞生物学
指导教师:罗深秋;钟梅
201106
/㈣┰龈逩緿序列的引物设计策略博士研究生:李莉艳指导教师:罗深秋教授、钟梅教授摘要背景与目的聚合酶链式反应技术,是一种核酸体外扩增技术,作为最基础的分子生物学技术之一,黄毡橛τ糜谛矶嘌芯苛煊颉S其随着际跤肫渌治黾际醯牧:嫌τ茫邮沟肞技术越来越广泛地渗透到分子生物学研究的诸多领域及学科,并大大加速了各相关领域的研究进程。虽然各种类型际醯幕痉从υ矶即笾孪嗤谑导形颐蔷;嵊龅难以扩增的勘晷蛄校绕湎喽杂诜歉逩緿序列而言,高含量蛄械腜扩增更是困难。虽然高含量蛄性谌死嗷蜃橹兄徽即约ィ浞段Ц哺橇税ㄆ舳印⒃銮孔雍推渌刂圃<谀诘拇蠖嗍匾调控区域;大多数看家基因、抑癌基因和约%的组织特异性基因的启动子区域也由高含量蛄凶槌伞U庑〥序列因其高含量导致针对它们而设计的托Щ蛭扌Ю┰鱿窒螅厝蛔璋烁鞲隽煊蚨哉胝庑┗虻南喙匮芯拷程。目前普遍认为,由高含量0搴停蛞锏淖陨砘ゲ够蚱渌瓜筇卣所引起的二级结构,如环状结构或发夹结构等,是导致扌Ю┰龅闹饕T颉为了解决高含量蛄蠵扩增效率低的问题,目前最普遍的做法是在┰鎏逑抵屑尤胍恢只蚴职ㄌ鸩思睢⒍谆琼俊⒓柞0贰⒕垡蚁非离子型去污剂、煌训#.脱氧鸟苷三磷酸和尿苷三磷酸等在内的鲂砑
于提高高含量蛄械腜扩增效率。同时调节笈ǘ取⒒撼逡簆怠剂,或者同时使用刑,,绕舳福琌合酶,酆厦傅雀咝聚合酶。另外,应用对模板进行预变性、燃际跻灿兄变性温度与时间、退火温度与时间和反问炔问谀承┣榭鱿乱蚕缘檬分必要。我们在详细分析了不同因素对┰鲂实挠跋旌螅衔F渲幸锷杓剖最为关键性的因素。在┰鲋埃返囊锷杓坪头治觯绕涫嵌砸镒身二聚体⒎⒓薪峁鸵锒灾涠厶猟等引物二级结构的分析是十分必要的。同时我们发现诸多文献中报道的高含量蛄欣┰鲆锒即嬖谧畔嗤娜毕荩纾航饬次露汀⒁锒灾浣饬次露炔钪△过高或者引物与0宥喔鑫点存在错配等。这些问题会引起引物与0逯渫嘶鹗О芑蛘咴谀0宓亩个位点退火,进一步导致扌Ю┰龌蛘叱鱿种疃喾翘匾煨岳┰觥R虼宋颐欠析,这些引物缺陷可能是导致扌Ю┰龅闹饕N侍猓纱耍颐侨衔Mü化高含量蛄械腜扩增引物,建立有效的引物设计方案,应该是解决高含量0錚无效、低效和非特异扩增最简易、便捷、低耗和高效的途径。本研究基于上述分析结果,针对引物设计中一些突出问题进行优化,建立了一种以高值和低引物对△差值为基础的特异性引物设计策略。根据这一设计策略,我们设计了对特异性引物用于高含量蛄械腜扩增,同时配合从μ逑档挠呕晒κ迪至擞τ闷胀═酆厦负推胀≒循环条件对个高含量0宓奶匾煨岳┰觥6哉帐笛橐餐毖橹ち宋颐钦庖策略的可行性。同时应用上述策略,针对个非高含量0褰幸锷计,结果所有个扩增子在统一的跫拢踩ú砍晒Φ幕竦昧颂匾煨岳┰产物。因此该引物设计策略在非高含量蛄蠵扩增中也具有普遍实用摘要蚐.
材料与方法性,同时还有助于多片段扩增时逑岛脱凡问母叨韧骋弧1狙芯课=饩高含量蛄蠵扩增问题提供了简便、低成本和高效的解决方案,而且也普遍适用于普通模板的┰觥M保狙芯慷圆煌┰鲎有蛄性谙嗤琍反应条件进行扩增从而实现际醯母咄刻峁┝思际踔С帧A硗猓狙芯拷果表明,引起高含量蛄蠵无效扩增的主要原因可能不是蛘咭物序列的二级结构,而是由于引物设计问题导致的引物退火不同步。瓺模板本研究共选用了个高含量和个非高含量0逍蛄凶魑Q芯对象。个高含量0逍蛄蟹直鹄醋个基因:、.、一.、一.、%%。鲜基因序列均来自于:////,在保证与0逍蛄谢ゲ沟那疤嵯拢A耸挂锞哂薪细叩腡岛徒系偷囊锒△差值,我们在每条引物的’端加入或去掉了一个或数个碱基。同时设计了对非高含量験┰龅奶匾煨砸铮匝橹じ靡锷杓撇呗栽非高含量蛄蠵扩增中的实用性。锏腉恳约鞍═担△差值,引物自身二聚体、引物对之间二聚体和发夹结构的最大自由能差等在内的引物参数∣砑,珻计算博士学位论文.、.
得到。我们同时又合成了两组引物作为对照实验。一组是将本研究中己设计好的用于高含量0錚扩增的对引物,在朔直鹑コ个碱基,称为截短引物,目的是验证高含量0逡锷杓浦懈逿档谋匾P裕涣硪蛔槭相关文献中条高含量0宓腜扩增引物。这两组引物与我们设计的引物用相同的跫床惶砑釉鲂Ъ梁筒皇褂锰厥釶方法,而用普通酆厦负推胀≒循环条件对其进行扩增,以对照这些镉氡狙芯恐设计的对引物的扩增效率。所有引物由公司合成。甈体系与扩增条件所有从μ逑底槌删#.的总反应体积中,⑾,四种各,┰龇从诿拦鶳镜腿妊芬巧辖小1狙芯可杓的针对个高含量0謇┰鲆锏