文档介绍：蛋白质纯化与结晶的原理
获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈,就是制备大量纯化的蛋白质(>10 mg),其浓度通常在10 mg/ml 以上,并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术,将特定基因以选殖(clone)的方式嵌入表现载体(expression vector)内,此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中,如大肠杆菌(Escherichia coli),在菌体快速生长的同时,也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体,因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。
在取得高纯度的蛋白质溶液后,接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似,是在饱和溶液中慢慢产生的,每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异,影响晶体形成的变量很多,包含化学上的变量,如酸碱度、沈淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等;物理上的变数,如溶液达成过饱和状态的速率、温度等;及生化上的变数,如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等,皆是养晶时的测试条件。截至目前为止,并无一套理论可以预测结晶的条件,所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后,才可能得到一颗完美的单一晶体(图一) 。
蛋白质晶体的培养,通常是利用气相扩散法(Vapor Diffusion Method) 的原理来达成;也就是将含有高浓度的蛋白质(10-50 mg/ml)溶液加入适当的溶剂,慢慢降低蛋白质的溶解度,使其接近自发性的沈淀状态时,蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说,我们将蛋白质溶于低浓度(~ M) 的硫酸铵溶液中,将它放置于一密闭含有高浓度(~ M)硫酸铵溶液的容器中,由气相平衡,可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度,进而达成结晶的目的(图二)。
蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处,但在晶体的内部,却有很大的差异。一般而言,蛋白质晶体除了蛋白质分子外,其他的空间则充满约40 %至60 %之间的水溶液,其液态的成分不仅使晶体易碎,也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现,造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性,让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态,极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构,基本上可视为自然状态下的结构。
蛋白质结构解析的方法简介
到目前为止,蛋白质结构解析的方法主要是两种,x射线衍射和NMR。近年来还出现了一种新的方法,叫做Electron Microscopy。其中X射线的方法产生的更早,也更加的成熟,解析的数量也更多,我们知道,第一个解析的蛋白的结构,就是用x晶体衍射的方法解析的。而NMR方法则是在90年代才成熟并发展起来的。这两种方法各有优点和缺点。
首先来说一下,这两种方法的一般的步骤和各自的优点和缺点。电子显微镜(electron microscopy)作为一种新型的技术,目前的应用还是非常少,并且比较狭窄,我可能等到最后在给它作些介绍,而且相信绝大多数人也没有听说过,也不会有很大的兴趣。
首先是X晶体衍射。首先要得到蛋白质的晶体。
通常,都是将表达蛋白的基因PCR之后克隆到一种表达载体中,然后在大肠杆菌中诱导表达,提纯之后摸索结晶条件,等拿到晶体之后,工作便完成的80%,将晶体进行x射