文档介绍：Ri质粒诱导喜树毛状根培养基中喜树碱的研究
刘展眉1,2 , 崔英德2
1. 广东工业大学轻工化工学院, 广东广州 510090; 2. 仲恺农业技术学院, 广东广州 510225
摘要:喜树(Camptotheca acuminate)可产生具有抗癌作用的喜树碱,有许多用细胞培养方法制备喜树碱的尝试,但都因极低的产率而无从深入。植物毛状根培养的应用将成为一种生物碱生产的替代方法。以发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) A4 感染喜树诱导产生毛状根,建立喜树碱毛状根产生体系。甘露碱检测及PCR结果证实发根农杆菌Ri质粒的rolB基因已在喜树毛状根基因组中整合并得到表达。确定了用RP-HPLC测定发根培养基中喜树碱的的方法,比较了不同的吸附树脂对培养基中喜树碱的富集能力,从培养30 d mg·g-1。
关键词: 喜树(Camptotheca acuminate);发根农杆菌;喜树碱
中图分类号:Q946 文献标识码:A 文章编号:1672-2175(2007)04-1266-05
Ri质粒诱导的发根具有生长迅速、激素自养、生长条件简单、次生代谢产物含量高且稳定,分化程度高、不易变异等特点,而且可把二次代谢物分泌至培养基中。从毛状根中分离检测出的次生代谢物质包括生物碱、蒽醌、萘醌、单萜、二萜、黄酮类、多糖类、皂苷、蛋白等各种成分,在这方面的研究取得了可喜的成就。MORGANT [1]建立的29个日本莨菪毛状根无性系均能生产阿托品烷生物碱,其质量的增加比正常植株的高出102倍,%,为原植株根中含量的3倍。Yoshikawa [2]通过人参愈伤组织诱导出毛状根,在无外源激素的条件下,其生长速度是愈伤组织的2倍,%高于再生根() 和天然栽培根(%)的含量,建立了发根农杆菌诱导人参产生人参皂苷的高效培养体。Hamill JD等人[3]用发根培养体系产生烟碱,烟碱含量与同品种体内根产生的烟碱水平相当。喜树(Camptotheca acuminate)为珙桐科(Nyssaceae)喜树属(Camptotheca e)植物;为中国特有树种。喜树全株都含喜树碱(Camptothecme),对胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肠癌、子宫颈肿瘤及艾滋病等到均有效,加之可以口服,且对心、肺、肝、肾和神经毒性较小,已成为世界抗肿瘤药物市场上主要品种。Yamazaki [4]用发根农杆菌(Rhizobiaeae)利用矮蛇根草(Ophiorrhiza pumila)发根培养生产喜树碱。矮蛇根草发根培养不仅能产生喜树碱,而且可把二次代谢物如喜树碱分泌至培养基中。目前,未见关于从喜树发根培养基中提取喜树碱及其次生代谢产物的报导。
为此,本文利用含Ri质粒的发根农杆菌对喜树进行诱导及转化,获得能在无激素的培养基上自主生长的毛状根,研究了毛状根生长条件及培养基中喜树碱的含量。为喜树发根的大量培养和提高喜树碱的含量奠定技术基础。
1 实验部分
主要仪器与材料
Thermo LQC·DECA×P 液相色谱-质谱连用仪,Finnign 公司(美国),带电喷雾离子源;大气压化学电离源,质量范围 50~2 000