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辽阳鑫宇实验室设备安装工程有限企业技术部
前言
基因扩增查验实验室一文,是依据国家有关法律、法例和技术规
范,进行选编、择录和采集有关资料、文章而编写的。选编和择录有
关技术规范等,若有错误是编著人理解有误,编者表示抱歉。
本文的平面图由黄海江、成效图赵玉、录入周悦同志达成。
柏松枫、何兴福、张璐、张伟卓、赵馨、赵俨、熊洁萌等编写。
陈洪柱参加校正。
总经理郎宪明(高级工程师)编导。
本文为内部参阅资料,仅供参照。
2015年2月
基因扩增(PCR)实验室
基因扩增查验方法(简称PCR)敏捷度高、特异性强、精准快捷、
合用范围广等特色。在生物学、医学科学研究、转基因产品、临床检
测、疾病与动物疫病预防和控制、公安侦察等有关专业和学科广为应
用。可是,PCR查验实验室应用时需保证明验安全、设置合理的实验
室、规范的操作程序和严格的管理制度。
近几年,对PCR实验室建设愈来愈获得重视,因为对检测结果的
靠谱性、正确性和安全性起到至关重要作用,PCR实验室设计核心问
题是怎样防止污染。实验室的平面布局、空调通风系统运转、气流控
制等都是环绕防备污染这个核心进行设计和建设。
PCR实验室组合形式
PCR实验室能够是分别形式,也能够是组合形式,此刻主假如以
组合形式为主。
分别形式PCR实验室
各功能区间分别,又有必定的间距,不会造成区间扰乱,所以没
有特定要求。因为工作流程的不便利,在新组建的PCR实验室时常常
不被采纳。
组合形式PCR实验室
在较大空间实验用房相邻部署挨次区分各功能地区,形成一个组
合形式达成基因扩增剖析的PCR实验室,各区间在物理空间上完整相
互独立,各区间不论是在空间仍是在使用中,一直处于完整的分开状
态。可是,各实验区间集中部署,简单造成互相扰乱,所以对整体布
局以及屏障系统拥有必定要求。对实验室的空调通风系统、气流流向、
大气压力、人物流程等方面,在实验室设计和装饰上需进行合理考虑。
PCR实验室的地区设计
PCR实验室分区
PCR实验室可分两个工作地区:核酸扩增前区和核酸扩增后区。
核酸扩增前区包含试剂准备区和样品办理区,设在不一样房间或地区;
核酸扩增后区包含扩增区和产物剖析区,设在不一样房间或地区。
PCR实验室依据使用仪器的功能合理设置各个地区,如
采纳聚合酶联反响:则设置试剂储藏和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物剖析区四个独自的工作地区。样品需要粉碎办理的,还需增设样品粉碎区;若使用及时荧光PCR法:基因扩增区、基因产物剖析区能够归并;采纳标本办理、核酸提取及扩增检测为一体的全自动化PCR剖析仪,则标本制备区、扩增区、扩增产物剖析区可归并为一个地区,所以PCR实验室原则上设置五个区或四个区或三个区或二个单
独的工作区。
核酸扩增前区和核酸扩增后区可设在一个房间内,但必
须在知足以下要求的前提下:
核酸扩增前区实验室内设置两个不一样地点的实验区,
试剂配置在超净工作台中操作,样品办理在生物安全柜内操作。
在核酸扩增后区使用全关闭的扩增和检测系统时,如
及时荧光PCR仪等。
每个实验人员使用各自的试剂、耗材、移液器和盛放
污染物的盛器。
在实验前后对操作地区和共享器具进行洁净及消毒。
各地区的试剂、器具、仪器和设备为该区专用,不得
交错使用。
PCR实验室各地区功能:
试剂储藏和准备区:扩增试剂的制备、试剂的分装和扩
增反响混淆液的制备以及离心管、吸优等耗费品的储藏和准备。
标本制备区:样品登记、办理和分装;核酸(RNA/DNA)
提取、保留和使用;PCR扩增的第一轮加样。对于波及样本的操作应
切合生物安全二级实验室防备标准或更高。
基因扩增区:cDNA合成和DNA扩增。假如在此区进行套
式PCR的第二轮加样,应在PCR防备罩内进行。
扩增产物剖析区:扩增产物的电泳、杂交、成像、序列
测定、变性高效液相剖析、结果剖析、登记及报告。
工作地区设备和仪器的配置。
试剂储藏和准备区
2-8℃和-20℃以下的冰箱、一般离心计、超净工作台、混匀器、
微量加样器(覆盖μL),耗费品(一次性手套、耐高压办理的离心管
和加样吸头)、专用工作服工作鞋(套)、专用办公用品和荒弃物容器、
可挪动紫外线灯。
标本制备区
2-8℃冰箱、-20℃(或-80℃)冰箱,生物安全柜、高速制冷离
心计(台式)、混匀器、恒温水浴箱或加热模块、制冰器或制冷模块、
微量加样器、耗费品(一次性手套、耐高压办理的离心管和加样吸头)、
专用工作服工作鞋(套)、上下水设备、专用办公用品和荒弃物容器、
紫外线杀菌灯。如需办理大分子的DNA应拥有超声波水浴仪。
扩增区
核酸扩增仪、微量加样器、耗费品(一次性手套、耐高压办理的
离心管和加样吸头)、专用工作服工作鞋(套)、专用办公用品和荒弃
物容器、紫外线杀菌灯。
扩增产物剖析区
视查验方法不一样而定,基本配置以下:电泳仪、电泳槽、拍照/
像设备、变性高效液相剖析仪、测序仪、紫外透射仪、一般冰箱、离
心计、恒温水浴、微波炉、上下水设备、紫外线灯、微量加样器、消
耗品(一次性手套、耐高压办理的离心管和加样吸头)、专用工作服
工作鞋(套)、专用办公用品和荒弃物容器。
各地区设备和仪器的装备,应依据使用的扩增检测技术或试剂特
点,对设备和仪器进行必需的增减。
PCR实验室单向流流向制度
实验室的空气单向流流向应当为:试剂储藏和准备区→
样品制备区→扩增区→扩增产物剖析区,不得逆向流动。扩增前区保
持微(弱)正压状态,扩增后区保持微(弱)负压状态。
实验用品单向流工作流向应当为:试剂储藏和准备区→
样品制备区→扩增区→扩增产物剖析区,不得逆向进行。实验用品包
括实验资料(试剂、样品和扩增产物)、实验器械(容器、板架、实
验服饰、帽子、口罩、手套、鞋套)、办公用品(记录纸、笔)、以及
洁净工具等。物件的传递是经过互锁式传达窗传达。
实验人员单向工作流流向应当为:进入各工作地区严格
依照试剂储藏和准备区→样品制备区→扩增区→扩增产物剖析区单
一方向进行,不得逆向走动。原则上实验人员应在扩增后区工作后当
天不得再返回扩增前区工作。在标本制备区因为加样的操作中可能会
发生气溶胶污染,所以应防止或减少在本区内不用要的走动。
实验室的单向洁净流流向应当为:试剂储藏和准备区→
样品制备区→扩增区→扩增产物剖析区的方向进行。不一样的实验地区
应当有各自的洁净器具,以防备交错污染。
PCR实验室工作基根源则和实验室各地区工作注意事项
严格的实验室分区制度;各地区一定有明确的标志,只
用于特定的操作,不得从事其余工作;不一样地区的设备物件(仪器、
设备、资料、洁净工具),不得交错使用。
不一样工作地区使用不一样工作服(比如不一样颜色),工作人
员走动工作地区时,不得将工作服带出。
实验前移入所需试剂、耗材、样品以及盛放污染物的容
器。
试剂储藏和准备区:储藏试剂和用于标本制备的耗费品
等资料须直接运送至本区,不可以经过扩增检测区。试剂盒中的阳性对
照品及质控品不可以保留在本区,应当保留在标本制备区。
标本制备区:因为在样品混淆、核酸纯化过程中可能会
发生气溶胶所致污染,可经过在本区内设正压条件,防止从周边地区
进入本区的气溶胶污染。为防止标本间的交错污染,加入待测核酸后,
一定盖好含反响混淆液的反响管。对拥有潜伏传染危险性的资料,必
须在生物安全柜内操做,并有明确的标本办理和灭活程序。
扩增区:为防止气溶胶所致的污染,应当尽量防止或减
少本区内的人员不用要的走动。一定注意所有经过检测的反响管不得
在本区内翻开。
扩增产物剖析区:核酸扩增后产物的剖析方法许多,如
膜上或微孔板或芯片上探针杂交方法(放射性核素标志或非放射性核
素标志)直接或酶切后琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰***凝胶电泳
southern转移、核酸测序方法、质谱剖析等。本区是最主要的扩增
产物污染根源,所以,一定注意防止经过本区物件及工作服将扩增物
带出。在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时,一定使用洗板机洗板,
废液一定采集在1moL/LHCL中,不可以在实验室内倾倒,应当远离
PCR实验室的地方弃掉。用过的吸头也一定放在1moL/LHCL中侵泡
后再放到荒弃物容器或垃圾袋中按程序办理。
工作结束事后,须对工作区进行洁净办理:对工作地区
的实验台面进行洁净消毒(如使用次***酸钠),实验台面采纳紫外线
照耀更加方便、成效更佳。因为紫外线照耀的距离和能量对于去污的
成效特别重点,可使用挪动紫外线灯(254nm波长),在工作达成后
调至实验台面上60-90cm范围内照耀。因为扩增产物仅几百和几十碱
基对(bp),对紫外线损害不敏感,所以紫外线照耀扩增片段一定延伸
照耀时间,最好是照耀留宿。
因为本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质,如溴化乙
锭、丙烯酰***、甲醛或放射性核素等,故应当注意实验人员的安全防
护。
PCR实验室建设与装饰
依据使用采纳仪器的不一样确立五个或四个或三个或二个地区,各
地区一定设置缓冲间,缓冲间宜设正压,使室内空气不流向室外,室
外空气不流向室内,以减少室内外空气互换。也可设专用走廊,但缓
冲间比专用走廊更加重要。
PCR实验室空气流向,可依照试剂贮备和准备区→标本制备区
→扩增区→扩增产物剖析区方向进行空气压力递减方式控制气流流
向,防备扩增产物顺空气气流逆向进入扩增前的地区。也可经过负压
排风装置、排电扇或其余可行的方式进行。
压差与净化级别
试剂储存和准备区、样品办理区应设微正压,以防备外
界核酸气溶胶的进入,造成污染,能够经过空气进风风量的大于排风
量达到正压成效。
核酸扩增区、产物剖析区应设微负压,防备含核酸的气
溶胶扩散出去而污染试剂与样品,造成假阳性结果,能够经过控制排
风风量大于进风风量达到负压成效。
PCR实验室并无严格的净化要求,若需要一般采纳净
化级别8或9级(即万级或十万级)。
PCR实验室空调通风系统及压力控制
为防止各个实验地区间交错感染的可能性,宜采纳全送全排的气
流组织形式。同时要严格控制送排风的比率,以保证各实验区的压力
要求。
试剂储藏和准备区:因为该区主要进行的操作为储藏试
剂的制备、试剂的分装和主反响混淆液的制备,对于气流压力的控制,
本区没有严格要求,但宜采纳微正压。
标本制备区:该地区主要进行的操作为标本的保留、核
酸(RNA、DNA)提取、储藏即加入至扩增反响管和测定RNA和DNA的
合成体。本区的压力梯度要求与相对相周边地区为正压,是为防止从
周边区进入本区气溶胶污染。
扩增区:扩增反响混淆物配制和扩增反响,该地区主要
进行的操作为DNA和CDNA扩增。别的,已制备的DNA模板和合成的
CDNA(来自标本制备区)的加入和主反响混淆液(来自试剂储藏和制
备区)制备成反响混淆液等也可在本区内进行。在巢式PCR测试中,
往常在第一轮扩增后一定翻开反响管,因为巢式扩增有较高的危险
性,第二次加样一定在本区内进行。所以,本区压力梯度要求为相对
周边地区为负压,以防止气溶胶从本区泻出。