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免疫荧光实验步骤
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免疫荧光实验步骤
免疫荧光实验步骤
直接免疫荧光法测抗原(1)基根源理
将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简略、特异性高,非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制
备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
2)试剂与仪器
??磷酸盐缓冲盐水(PBS):,
??荧光标记的抗体溶液:,
??缓冲甘油:解析纯无荧光的甘油9份+
??搪瓷桶三只(,)
??有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸润的纱布垫)
??荧光显微镜
??玻片架
??滤纸
??37℃温箱等。
3)实验步骤
①,,10min后弃去,使标本保持必然湿度。
②滴加合适稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完好覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温一准时间(参照:30min)。
③取出玻片,置玻片架上,,,再按序次过
,,每缸3-5min,不时振荡。
④取出玻片,用滤纸吸去节余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。
⑤马上用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:
-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光光明;(+++--++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种比较显示为(±)或(-),即可判断为阳性。
4)注意事项
对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有必然的浓度,一般稀释度不应高出1:20,抗体浓度过低,会以致产生的荧光过弱,影响结果的观察。
2)染色的温度和时间需要依照各种不同样的标本及抗原而变化,染色时间可以从
10min到数小时,一般30min已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于37℃可加强染色收效,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用
0-2℃的低温,延长染色时间。低温染色过夜较37℃30min收效好的多。
为了保证荧光染色的正确性,首次试验时需设置下述比较,以消除某些非特异性荧光染色的搅乱。
①标本自觉荧光比较:标本加1-,。
②特异性比较(控制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体。
③阳性比较:已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
若是标本自觉荧光比较和特异性比较呈无荧光或弱荧光,阳性比较和待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。
一般标本在高压***灯下照射高出3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本最幸好当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。
间接免疫荧光法测抗体
1)基根源理
染色程序分为两步,第一步,用未知未标记的抗体(待检标本)加到已知抗原标本上,在湿盒中37℃保温30min,使抗原抗体充分结合,尔后冲洗,除去未结合
的抗体。第二步,加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。若是第一步发生了抗原抗体反应,标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合,从而可判断未知抗体。
2)试剂与仪器
??磷酸盐缓冲盐水(PBS):,
??缓冲甘油:解析纯无荧光的甘油9份+。
??荧光标记的抗人球蛋白抗体:,。
??搪瓷桶三只(,)
??有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸润的纱布垫)
??荧光显微镜
??玻片架
??滤纸
??37℃温箱等。
3)实验步骤
,,10min后弃去,使标本片保持必然湿度。
,,覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内,37℃保温30min。
取出玻片,置于玻片架上,,-2次,,,每缸5min,不时振荡。
取出玻片,用滤纸吸去节余水分,但不使标本干燥,滴加一滴必然稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。
将玻片平放在有盖搪瓷盒内,37℃保温30min。
重复操作3。
取出玻片,用滤纸吸去节余水分,滴加一滴缓冲甘油,再覆以盖玻片。
荧光显微镜高倍视野下观察,结果判断同直接法。
4)注意事项
荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,时间过长,会使荧光减弱。
2)每次试验时,需设置以下三种比较:
免疫荧光实验步骤
免疫荧光实验步骤
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免疫荧光实验步骤
①阳性比较:阳性血清+荧光标记物
②阴性比较:阴性血清+荧光标记物
③荧光标记物比较:PBS+荧光标记物
已知抗原标本片需在操作的各个步骤中,向来保持湿润,防备干燥。
所滴加的待检抗体标本或荧光标记物,应向来保持在已知抗原标本片上,防备因放置不平使液体流失,从而造成非特异性荧光染色。
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