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JSouthMedUniv,2022,42(8):1205-.1673-
和厚朴酚可体外减轻阿霉素诱导的心肌毒性:基于激活AMPK/
Nrf2信号通路抑制细胞焦亡
熊凤梅1,刘瑞萍2,李洋1,孙娜3
西安市儿童医院1药剂科,2营养科,陕西西安710003;3西安医学院基础部基础医学研究所,陕西西安710021
摘要:目的探讨和厚朴酚(HKL)改善阿霉素(DOX)诱导的H9c2心肌细胞毒性的作用及机制。方法采用DOX处理H9c2细胞
心肌毒性模型,随机分为4组:正常对照组、DOX处理组(DOX)、HKL和DOX共处理组(DOX+HKL)以及HKL、腺苷酸活化蛋
白激酶(AMPK)抑制剂和DOX共处理组(DOX+HKL+AMPK抑制剂)。24h后观察细胞形态变化,用CCK-8法检测细胞活力,
RT-PCR检测炎性因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)的mRNA水平,Westernblot检测
裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、细胞色素c和细胞焦亡分子NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、半
胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)以及p-AMPK、红系衍生核因子相关因子2(Nrf2)的表达,免
疫荧光染色观察NLRP3和p-AMPK的表达。结果和正常对照组相比,DOX组H9c2细胞变得肿胀且细胞活力明显降低(P<
),TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平显著增加(P<),同时裂解的caspase-3、细胞色素c、NLRP3、Caspase-1和ASC表达
增加(P<),p-AMPK和Nrf2表达降低(P<),NLRP3荧光染色强度增加,p-AMPK荧光强度降低;和DOX组相比,DOX+
HKL组细胞肿胀减轻,细胞活力明显增加(P<),TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平显著降低(P<),裂解的caspase-3、细
胞色素c、NLRP3、Caspase-1和ASC表达降低(P<),而p-AMPK和Nrf2表达增加(P<),另外NLRP3荧光染色强度降低,
p-AMPK荧光强度增加;和DOX+HKL组相比,AMPK抑制剂可以逆转HKL对DOX心肌的保护作用。结论HKL可通过抑制
细胞焦亡减轻DOX引起的H9c2心肌细胞毒性损伤,这一作用与激活AMPK调控Nrf2信号有关。
关键词:和厚朴酚;阿霉素;心肌毒性;细胞焦亡
Honokiolreducesdoxorubicin-inducedcardiotoxicityinvitrobyinhibitingpyroptosisvia
activatingAMPK/Nrf2signaling
XIONGFengmei1,LIURuiping2,LIYang1,SUNNa3
1DepartmentofPharmacy,2DepartmentofNutrition,Xi'anChildren'sHospital,Xi'an710003,China;3InstituteofBasicMedicalScience,
Xi'anMedicalUniversity,Xi'an710021,China
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofhonokiol(HKL)forreducingdoxorubicin(DOX)-inducedcardiotoxicityin
,DOXgroup,HKL+DOX
group,andHKL+compoundC+,thecellswereexaminedformorphological
changesandcellviabilityusingCCK-
factor-α(TNF-α),interleukin-6(IL-6)andinterleukin-1β(IL-1β)weredetectedbyRT-PCR,andtheproteinlevelsofcleaved
caspase-3,cytochromec,NOD-likereceptorpyrindomaincontaining3(NLRP3),caspase-1,apoptosis-associatedspeck-like
proteincontainingaCARD(ASC),p-AMPKandnuclearfactor(erythroid-derived2)-like2(Nrf2)weredetectedwithWestern
blotting;theexpressionsofNLRP3andp-
causedswellingandsignificantlyloweredtheviabilityofH9c2cells(P<),resultingalsoinincreasedmRNAexpressionsof
TNF-α,IL-6andIL-1β(P<)andproteinexpressionsofcleavedcaspase-3,cytochromec,NLRP3,caspase-1andASC(P<
)butreducedproteinlevelsofp-AMPKandNrf2(P<);fluorescencestainingshowedsignificantlyincreasedNLRP3
expressionanddecreasedexpressionofp-AMPKinDOX-treatedcells(P<).AllthesechangesinCOX-treatedcellswere
significantlyalleviatedbyHKLtreatment(P<).TheapplicationofcompoundCobviouslymitigatedtheprotectiveeffects
ofHKLagainstDOX--inducedcardiotoxicityby
inhibitingpyroptosisinH9c2cells,andthiseffectismediatedbyactivationofAMPKtoregulateNrf2signaling.
Keywords:honokiol;doxorubicin;cardiotoxicity;pyroptosis
阿霉素作为蒽环类药物,是临床上常用的一线广谱以往的研究表明,阿霉素引起心脏毒性的病理机制包括
抗癌药,其最主要的副作用是时间和剂量依赖的心脏毒DNA拓扑异构酶损伤、活性氧(ROS)诱导的线粒体损
性,长期用药会导致进行性扩张型心肌病和心力衰竭[1]。伤、氧化应激、蛋白质合成受损、胆碱能神经功能下调和
心肌细胞凋亡等[2-5]。然而,这些机制并没有转化为有效
收稿日期:2022-03-20的临床治疗手段,目前临床上也仅有右雷佐生用于防治阿
基金项目:陕西省科技厅社发项目(2020SF-002);西安市儿童医院院级课
霉素引起的心脏毒性,但它会降低阿霉素的抗癌效果[6]。
题扶持项目(2020C01)
因此,深入探讨阿霉素诱导心脏毒性的新机制以及新的
作者简介:熊凤梅,硕士,主管药师,E-mail:******@
通信作者:孙娜,博士,副教授,E-mail:******@。
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和厚朴酚(HKL)是从木兰属植物中提取的一种生和1μmol/L阿霉素的培养基共同处理细胞24h。根据
物活性物质,也是临床上广泛使用的一类传统中药[7]。文献确定DOX、HKL和Compoundc的使用浓度[16-18]。
研究表明HKL具有广泛的药理作用,如抑制肿瘤生长、-8法检测细胞活力
抗心律失常、抑制心肌肥厚和抗氧化应激等[8-9]。HKLH9c2细胞消化后接种于96孔板,待细胞贴壁,按
可以清除ROS保护DNA免受氧化应激损伤。同时照分组给予不同处理后,在每孔中加入10μLCCK-8反
℃
HKL能通过抑制炎症因子的表达,消除白细胞浸润并应液,避光37恒温孵育2h,检测各组吸光值A450nm,按
刺激iNOS产生进而发挥抗炎作用[10]。此外,有研究表照说明书计算各组细胞活力。
明HKL通过激活SIRT3抑制ROS生成,-PCR检测TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平
能进而减轻阿霉素心脏毒性[11]。作为一种由炎性小体用Trizol提取各组H9c2细胞中总的RNA,然后用
介导的细胞死亡方式,细胞焦亡在阿霉素激活Toll样受体DNA酶I消除DNA。用RT-PCR试剂盒将RNA反转录
4和NLRP3炎性小体导致的心脏毒性中发挥了重要为cDNA。在Bio-RadCFX96仪上检测TNF-α、IL-6、
作用[12]。同时,HKL可通过抑制NLRP3炎性小体降低IL-1β和GAPDH的mRNA水平。引物序列如下:TNF-
炎症反应和细胞焦亡减轻急性肺损伤[13]。以往研究发α正义链(5’-3’):CTCACACTCAGATCATCTTC,反义
现腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/红系衍生核因子相关链(5’-3’):GAGAACCTGGGAGTAGATAAG;IL-6正
因子2(Nrf2)信号在LPS诱导的炎症和氧化应激损伤以义链(5’-3’):CAGAGTCATTCAGAGCAATAC,反义
及心肌缺血再灌注中发挥重要作用[14-15]。但HKL能否链(5’-3’):CTTTCAAGATGAGTTGGATGG;IL-1β正
通过激活AMPK调控Nrf2信号抑制细胞焦亡改善阿霉义链(5’-3’):TAAGCCAACAAGTGGTATTC,反义链
素心脏毒性目前尚未见报道。本研究将采用H9c2心肌(5’-3’):AGGTATAGATTCTTCCCCTTG;GAPDH正
细胞,探讨HKL能否通过抑制细胞焦亡引起的炎症反义链(5’-3’):AGGTCGGTGTGAACGGATTTG,反义
应减轻阿霉素诱导的心肌毒性及其可能的作用机制。链(5’-3’):TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。
-AMPK的表达
1材料和方法将各组处理好的细胞先用PBS冲洗,用4%多聚甲
℃
,然后用山羊血清封闭,在4下用NLRP3抗
H9c2心肌细胞(ScienCell);HKL和阿霉素体和p-AMPK抗体孵育过夜,然后在室温下用Cy3山羊
(Sigma);CCK-8细胞活力检测试剂盒、BCA蛋白定量抗兔IgG孵育2h。用PBS在摇床上洗涤3次,然后用
℃
试剂盒和RIPA裂解液(碧云天);抗裂解的半胱氨酸天DAPI避光37复染细胞核。在暗室中用激光共聚焦
冬氨酸蛋白酶3(Cleavedcaspase-3)、细胞色素c显微镜随机拍照,保存图像。
(Cytochromec)、
(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、凋采用RIPA裂解液提取细胞蛋白后,BCA试剂盒进
亡相关斑点样蛋白(ASC)、p-AMPK、AMPK和Nrf2抗行蛋白定量,用10%SDS聚丙烯酰***凝胶电泳分离蛋
体(CellSignalingTechnology);GAPDH(武汉三鹰生白样品,每孔蛋白量约30μg,恒压湿转将蛋白转移到
物技术有限公司);RT-PCR试剂盒(天根生化科技有限PVDF膜上。室温下,用含有5%脱脂奶粉的TBST缓冲
公司);肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白液封闭2h,将目的条带切下并放入相应的抗Cleaved
细胞介素-1β(IL-1β)和GAPDH的引物(GenScript生物caspase-3(1∶1000)、抗Cytochromec(1∶1000)、抗
科技公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗NLRP3(1∶1000)、抗Caspase-1(1∶1000)、抗ASC(1∶
小鼠IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。1000)、抗p-AMPK(1∶1000)、抗AMPK(1∶1000)、抗
℃
(1∶1000)和抗GAPDH(1∶5000)抗体中4过夜。
H9c2心肌细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养然后用TBST洗涤3次,室温下用含辣根过氧化物酶的
℃
基在37恒温5%CO2的培养箱内培养。待细胞状态山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗孵育2h。再用TBST洗
稳定后,将H9c2细胞随机分为:正常对照组(Control):涤3次,用化学发光剂在ImageLab软件检测条带灰
细胞正常培养24h;阿霉素处理组(阿霉素):用含度值。
1μmol/L阿霉素的培养基处理细胞24h;
阿霉素处理组(DOX+HKL):用含5μmol/
1μmol/L阿霉素的培养基共同处理细胞24h;HKL、析,数据以均数±标准差表示,采用单因素方差分析比较
Compoundc联合阿霉素处理组(DOX+HKL+不同组间的差异,比较两组间的差异采用Tukey检验,
Compoundc):用含5μmol/LHKL、10μmol/LCompoundcP<。
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2结果DOX+HKL组细胞形态改善,细胞活力增加(P<);
+HKL组比较,DOX+HKL+Compoundc组细
与Control组比较,阿霉素组细胞明显肿胀,数量减胞肿胀,细胞活力又明显降低(P<,图1)。
少,细胞活力显著降低(P<);与阿霉素组比较,
AB
120
100
#
80
60
*&
ControlDOX40
20
elvaiiy(Control)(%viabilityCell
0
ControlDOX
DOX+HKL
DOX+HKL+Compoundc
DOX+HKLDOX+HKL+Compoundc
图1Compoundc逆转HKL对DOX组细胞活力的作用
-:MorphologyofH9c2cellsineach
group(Originalmagnification:×100).B:Comparisonofcellviabilityamongthegroups.*P<,#P<
group,&P<+HKLgroup.
(P<);而与DOX+HKL组比较,
作用DOX+HKL+Compoundc组Cleavedcaspase-3和
与Control组比较,阿霉素组Cleavedcaspase-3和Cytochromec蛋白表达又明显增加(P<,图2)。
Cytochromec蛋白表达明显增加(P<);
比较,DOX+HKL组Cleavedcaspase-3和CytochromecmRNA表达的作用
*&
Cleavedcaspase-
/
Cytochromec3#
GAPDH
laecaspase-Cleaved0
*&
ControlDOX
+HKL
DOX+HKL+Compoundc
#
图2Compoundc逆转HKL对DOX组细胞
agaisntDOX-::
yohoec/GAPDHCytochrome
:DOX+:DOX+HKL+Compound
c.*P<,#P<
ControlDOXgroup,&P<+HKLgroup.
DOX+HKL
DOX+HKL+Compoundc
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与Control组比较,阿霉素组TNF-α、IL-6和IL-1β降低(P<);与DOX+HKL组比较,DOX+HKL+
的mRNA水平显著增加(P<);与阿霉素组比较,Compoundc组TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平又显
DOX+HKL组TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平明显著增加(P<,图3)。
*&*&
*
&
#
##
RAlevel/GAPDHmRNA
RAlevel/GAPDHmRNA
α
IL-
-
TNF-0
00
DOXDOX
DOXControlControl
ControlDOX+HKLDOX+HKL
DOX+HKL
DOX+HKL+CompoundcDOX+HKL+Compoundc
DOX+HKL+Compoundc
图3Compoundc逆转HKL对DOX组炎症因子的作用
-:TNF-:IL-6
-1βmRNAlevel.*P<,#P<,&P<+HKLgroup.
,但确切的机制仍不十分清楚。本
作用实验通过H9c2细胞体外研究证实,HKL可激活AMPK/
与Control组比较,阿霉素组NLRP3、Caspase-1和Nrf2信号减少细胞凋亡和细胞焦亡,抑制炎症反应,进
ASC蛋白表达显著增加,同时NLRP3荧光染色强度增而减轻阿霉素导致的心脏毒性。
加(P<);与阿霉素组比较,DOX+HKL组NLRP3、心肌细胞作为终末分化细胞,基本丧失了分裂增殖
Caspase-1和ASC蛋白表达明显减少,NLRP3荧光染色能力[22]。阿霉素所导致的心肌细胞损伤甚至细胞死亡,
强度增加降低(P<);与DOX+HKL组比较,DOX+引起心肌细胞数量不可逆减少、心脏病理性重塑以及心
HKL+Compoundc组NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白脏功能障碍,是阿霉素诱导心脏毒性的重要原因[23-25]。
表达显著增加,NLRP3荧光染色强度增加(P<,本研究结果发现,阿霉素处理会导致H9c2细胞肿胀死
图4)。亡,同时,细胞凋亡蛋白Cleavedcaspase-3和
;而HKL可明显改善阿霉素
号的调控作用导致的细胞损伤,降低Cleavedcaspase-3和
与Control组比较,阿霉素组p-AMPK和Nrf2蛋白Cytochromec的表达,这表明HKL可以抑制阿霉素引
表达显著降低(P<),p-AMPK的荧光染色程度降起的细胞凋亡;然而,AMPK特异性抑制剂Compoundc
低;与阿霉素组比较,DOX+HKL组p-AMPK和Nrf2蛋可逆转HKL对心肌细胞损伤和细胞凋亡的保护作用。
白表达明显增加(P<),p-AMPK的荧光染色程度增以上这些结果说明,HKL能抑制阿霉素引起的细胞损
加;与DOX+HKL组比较,DOX+HKL+Compoundc组伤和凋亡,而这一作用依赖于AMPK信号。
p-AMPK和Nrf2蛋白表达显著降低(P<),p-AMPKNLRP3炎症小体是细胞焦亡中研究较为清楚的一
的荧光染色程度降低(图5)。类胞浆大分子蛋白复合物,其炎症小体组装形成后可通
过剪切Caspase-1前体,激活Caspase-1进而促进IL-1β
3讨论和IL-18等炎症因子的成熟和释放,引起细胞焦亡和炎
由于具有广谱抗癌作用,阿霉素在临床上被广泛用症反应[26-27]。研究表明多种心血管疾病的危险因素如糖
于治疗各类恶性肿瘤。然而,阿霉素剂量和时间依赖性尿病、高血压、肥胖、脂质代谢紊乱等均可以通过激活
的心脏毒性会导致左心室功能障碍并最终出现心力衰NLRP3炎症小体,参与心血管疾病的发生[28-29]。本研究
竭,这在很大程度上限制了阿霉素的临床应用。阿霉素发现,阿霉素处理会导致炎症反应增强,表现为TNF-α、
导致心脏毒性的主要原因包括:过量的ROS堆积造成IL-6和IL-1β的mRNA水平增加,同时,炎症小体蛋白
脂质、DNA和蛋白的损伤,拓扑异构酶2β导致的DNANLRP3、Caspase-1和ASC表达升高;HKL可明显抑制
链断裂以及线粒体损伤等[19-21]。尽管大量研究报道了阿阿霉素引起的TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平以及
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-,2022,42(8):1205-12111209
AEDOX+HKL+
ControlDOXDOX+HKLCompoundc
3
abcd
NLRP3
ASC
Caspase-1
GAPDH
egdDPNLRPDAPIMerged
*
&*
*&&
#
#/
1
/GAPDH#
Caspase-
000
DOX
ControlControlDOXControlDOX
DOX+HKLDOX+HKLDOX+HKL
DOX+HKL+CompoundcDOX+HKL+CompoundcDOX+HKL+Compoundc
图4Compoundc逆转HKL对DOX组细胞焦亡的作用
-:Representativeimmunoblotsof
NLRP3,ASC,caspase-:::DOX+:DOX+HKL+-D:Densitometric
analysesofNLRP3,ASCandcaspase-(×200).*P<,#P<
,&P<+HKLgroup.
NLRP3、Caspase-1和ASC的表达,这些结果说明HKL素中p-AMPK和Nrf2的表达,这表明HKL可以激活
能抑制阿霉素引起的炎症反应和细胞焦亡;而AMPK/Nrf2信号;更为重要的是,Compoundc能阻断
Compoundc可逆转HKL对阿霉素心肌细胞TNF-α、IL-HKL对阿霉素中p-AMPK和Nrf2表达的上调,提示抑
6和IL-1β的mRNA水平以及NLRP3、Caspase-1和ASC制AMPK可以阻断HKL对AMPK和Nrf2信号的调控。
的表达,以上结果说明AMPK信号在HKL对阿霉素心综合以上结果可以看出,HKL激活AMPK调控Nrf2信
肌细胞焦亡和炎症反应的作用中扮演了重要角色。号在改善阿霉素心肌毒性中发挥至关重要的作用。
AMPK是细胞内调控能量代谢的重要信号分子,本实验证实HKL可通过抑制细胞焦亡和炎症反应
其在多种炎症或自身免疫疾病模型中发挥显著的抗炎减轻阿霉素引起的心肌毒性。此外,有研究发现阻断
和免疫抑制作用[30]。AMPK可通过抑制NF-κB和AMPK可调控Nrf2信号,而抑制Nrf2后对AMPK几乎
p38MAPK信号减轻炎症反应[14];另外,二甲双胍能通过没有影响[15],这与本实验发现的HKL保护作用与激活
激活AMPK抑制Toll样受体4的表达减轻LPS引起的AMPK调控Nrf2信号有关一致,提示AMPK是Nrf2的
心肌炎症反应[31]。而Nrf2是一种关键的调控氧化还原上游调控分子。由于本研究未对Nrf2信号进行干预,
转录因子,激活后转位至细胞核,通过抗氧化反应元件不能明确Nrf2在HKL减轻阿霉素心脏毒性中的作用。
与DNA结合,上调HO-1的表达减轻氧化应激,促进细但本研究为HKL在抗肿瘤药物引起的心脏毒性中发挥
胞存活[32]。本实验结果显示,阿霉素处理会导致H9c2保护作用提供了证据,并为HKL在临床上防治抗肿瘤
细胞中p-AMPK和Nrf2表达降低,而HKL能上调阿霉药物心脏毒性提供了实验依据。
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##
p-
&
AMPK*&/GAPDH*
p-AMPK/
0
GAPDH0
ControlDOX
ControlDOXDOX+HKL
DOX+HKL
DOX+HKL+Compoundc
DOX+HKL+Compoundc
DOX+HKL+
ControlDOXDOX+HKLCompoundc
D
egdp-AMPKMerged
图5Compoundc逆转HKL对DOX组AMPK/Nrf2信号的作用
-inducedAMPK/:Representative
immunoblotsofp-AMPK,AMPK,Nrf2andGAPDH(a:::DOX+:DOX+HKL+Compoundc).
B,C:Densitometricanalysesofp-:Representativeimagesof